BcGs1是作者實(shí)驗(yàn)室從灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)代謝物中分離的細(xì)胞壁降解酶,能激發(fā)番茄和煙草一系列免疫防御反應(yīng),提高番茄和煙草的抗病性。為了進(jìn)一步明確激發(fā)子BcGs1激發(fā)植物免疫的調(diào)控機(jī)制,本文對(duì)分離純化得到的BcGs1進(jìn)行體外糖苷酶活性檢測(cè),并進(jìn)行了誘導(dǎo)番茄抗灰霉病最佳時(shí)間的生物學(xué)測(cè)定,通過(guò)蛋白瞬時(shí)表達(dá)和原核表達(dá)對(duì)BcGs1的不同功能域進(jìn)行了激發(fā)子活性鑒定。采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了BcGs1誘導(dǎo)番茄后顯著性差異表達(dá)的蛋白,同時(shí)結(jié)合熒光定量PCR驗(yàn)證、ROS積累、酶活性檢測(cè)以及組織細(xì)胞學(xué)觀察,闡述了激發(fā)子BcGs1誘導(dǎo)番茄抗病性的機(jī)制。具體結(jié)果如下:1.分離純化的激發(fā)子BcGs1誘導(dǎo)番茄后,能夠引起細(xì)胞的快速壞死;顯著提高番茄對(duì)灰葡萄孢菌的抗性。BcGs1滲入番茄,煙草,豌豆和黃瓜葉片組織12-24 h,能引起這些寄主細(xì)胞壞死,說(shuō)明BcGs1能激發(fā)寄主細(xì)胞壞死。以最低誘導(dǎo)濃度0.25μM BcGs1處理番茄植株后72 h接種灰葡萄孢菌,侵染面積比對(duì)照減少了23.3%。2.BcGs1具有糖苷酶活性,能水解淀粉和海帶多糖,但不能水解羥甲基纖維素和微晶纖維素。BcGs1...

【文章頁(yè)數(shù)】：68 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 激發(fā)子的研究現(xiàn)狀
    1.2 激發(fā)子誘導(dǎo)植物免疫反應(yīng)模式
    1.3 激發(fā)子誘導(dǎo)植物獲得抗病性的機(jī)制
    1.4 細(xì)胞壁降解酶類激發(fā)子的研究進(jìn)展
    1.5 ITRAQ技術(shù)
    1.6 灰葡萄孢菌與植物互作特性
    1.7 BCGS1研究背景
    1.8 研究的目的和意義
    1.9 技術(shù)路線
第二章 BcGs1誘導(dǎo)番茄對(duì)灰霉病的抗病性
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 試驗(yàn)菌株
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
        2.1.3 數(shù)據(jù)分析工具與方法
    2.2 蛋白 BcGs1 的制備與活性檢測(cè)
    2.3 蛋白濃度檢測(cè)
    2.4 BCGS1誘導(dǎo)番茄對(duì)灰葡萄孢菌的抗性測(cè)定
    2.5 結(jié)果與分析
        2.5.1 BcGs1蛋白純化與活性檢測(cè)
        2.5.2 BcGs1誘導(dǎo)番茄抗病性最佳誘導(dǎo)時(shí)間
    2.6 結(jié)果與討論
第三章 蛋白BcGs1的糖苷酶活性及功能域鑒定
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 儀器和試劑
        3.1.2 菌株與載體
        3.1.3 培養(yǎng)基與試劑配方
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 BcGs1酶活性檢測(cè)
        3.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
        3.2.3 BcGs1蛋白的酶活性測(cè)定
        3.2.4 瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.5 原核表達(dá)體系的構(gòu)建
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 蛋白BcGs1酶活性檢測(cè)
        3.3.2 構(gòu)建了蛋白BcGs1、GH15、CBM20的瞬時(shí)表達(dá)載體
        3.3.3 不同蛋白瞬時(shí)表達(dá)與Western blot驗(yàn)證
        3.3.4 成功構(gòu)建pET-30a-GH15原核表達(dá)載體
        3.3.5 蛋白GH15表達(dá)純化和Western blot檢測(cè)
        3.3.6 GH15蛋白活性檢測(cè)
    3.4 小結(jié)與討論
第四章 BcGs1誘導(dǎo)番茄抗病性的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 供試植株
        4.1.2 儀器與試劑
        4.1.3 數(shù)據(jù)分析
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)流程圖
        4.2.2 蛋白提取
        4.2.3 蛋白定量檢測(cè)
        4.2.4 蛋白SDS-PAGE電泳
        4.2.5 蛋白Trypsin酶解
        4.2.6 肽段標(biāo)記和等量混合
        4.2.7 蛋白highPH-RP分級(jí)
        4.2.8 蛋白質(zhì)譜分析
        4.2.9 數(shù)據(jù)分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 蛋白定量分析
        4.3.2 常規(guī)HPLC分離
        4.3.4 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果
        4.3.5 定量差異蛋白分析
        4.3.6 GO功能富集分析
        4.3.7 KEGG代謝通路分析
    4.4 小結(jié)與討論
第五章 BcGs1誘導(dǎo)番茄抗病差異蛋白基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析及防御物質(zhì)積累
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 供試植株
        5.1.2 儀器與試劑
        5.1.3 分析與設(shè)計(jì)軟件
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 特異性引物設(shè)計(jì)
        5.2.2 BcGs1處理番茄植株
        5.2.3 BcGs1處理番茄樣品總RNA提取
        5.2.4 cDNA第一鏈的合成
        5.2.5 目的基因qPCR擴(kuò)增
        5.2.6 熒光定量PCR結(jié)果分析
    5.3 早期防御反應(yīng)檢測(cè)
        5.3.1 H2O2生成及含量檢測(cè)
        5.3.2 BcGs1誘導(dǎo)的關(guān)鍵酶PAL和POD含量檢測(cè)
        5.3.3 BcGs1誘導(dǎo)番茄木質(zhì)素生成
    5.4 結(jié)果與分析
        5.4.1 番茄樣品總RNA提取
        5.4.2 BcGs1誘導(dǎo)番茄抗性差異蛋白相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄分析
        5.4.3 BcGs1誘導(dǎo)番茄葉片H2O2積累
        5.4.4 BCGS1誘導(dǎo)番茄組織中防御關(guān)鍵酶的活性
        5.4.5 BcGs1誘導(dǎo)番茄細(xì)胞木質(zhì)素積累
        5.4.6 BcGs1誘導(dǎo)番茄細(xì)胞壁增厚
    5.5 小結(jié)與討論
第六章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3840018