松樹(shù)萎蔫病(Pine Wilt Disease,PWD)又稱(chēng)松材線(xiàn)蟲(chóng)病,是一種毀滅性森林病害,在東亞和歐洲部分地區(qū)發(fā)生為害嚴(yán)重。近年該病在我國(guó)的疫情不斷擴(kuò)展蔓延,已經(jīng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)威脅,其病原松材線(xiàn)蟲(chóng)(Bursaphelenchus xylophilus)被我國(guó)評(píng)定為一級(jí)危險(xiǎn)性林業(yè)有害生物。由于松材線(xiàn)蟲(chóng)病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程復(fù)雜,其致病機(jī)理仍未明確,防治十分困難。闡明松材線(xiàn)蟲(chóng)如何克服環(huán)境變化和松樹(shù)防御反應(yīng)而成功侵染定殖于樹(shù)體的分子機(jī)制對(duì)有效防控松材線(xiàn)蟲(chóng)病具有十分重要的意義。細(xì)胞自噬是真核生物為應(yīng)對(duì)環(huán)境應(yīng)激而進(jìn)化出的一種由一系列自噬基因調(diào)控的保護(hù)性機(jī)制,其通過(guò)降解胞內(nèi)組分以維持生理平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫防御等生理和病理過(guò)程中都具有重要的作用。然而目前關(guān)于病原松材線(xiàn)蟲(chóng)細(xì)胞自噬的研究甚少。為此本文對(duì)細(xì)胞自噬在松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染寄主和適應(yīng)環(huán)境變化過(guò)程中的作用進(jìn)行了探討,以期促進(jìn)對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)致病機(jī)制和生態(tài)適應(yīng)機(jī)理的闡明。主要研究結(jié)果如下:1.通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡分析比較自噬標(biāo)志蛋白BxATG8-II與BxATG8-I表達(dá)量的變化,建立了定量檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)細(xì)胞自噬活性的方法。檢測(cè)自噬...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
abstract
前言
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 松材線(xiàn)蟲(chóng)病研究概況
        1.1 松材線(xiàn)蟲(chóng)病的發(fā)生與分布
        1.2 病原松材線(xiàn)蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)特征和生活史
        1.3 松材線(xiàn)蟲(chóng)致病機(jī)制研究
        1.4 感病寄主的生理和病理變化
    2 細(xì)胞自噬發(fā)生過(guò)程研究概述
        2.1 細(xì)胞自噬的發(fā)現(xiàn)
        2.2 細(xì)胞自噬的類(lèi)型
        2.3 自噬的形成過(guò)程及相關(guān)分子機(jī)制
            2.3.1 自噬的起始階段
            2.3.2 自噬體的延伸階段
            2.3.3 自噬體的成熟降解階段
    3 細(xì)胞自噬作用的研究進(jìn)展
        3.1 自噬在模式動(dòng)物秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中的作用研究
            3.1.1 自噬對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)存活的影響
            3.1.2 自噬對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響
        3.2 自噬在植物病原真菌中的作用研究
        3.3 自噬在植物中的作用研究
        3.4 自噬在人類(lèi)疾病中的作用研究
    4 細(xì)胞自噬的研究方法
        4.1 細(xì)胞自噬的檢測(cè)方法
        4.2 RNA干擾技術(shù)及其應(yīng)用
        4.3 實(shí)時(shí)定量PCR及其應(yīng)用
    5 本研究的意義
第二章 松材線(xiàn)蟲(chóng)細(xì)胞自噬活性定量檢測(cè)方法的建立
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料及其培養(yǎng)
        1.2 松材線(xiàn)蟲(chóng)總RNA的提取和cDNA的合成
        1.3 松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬標(biāo)志蛋白BxATG8原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        1.4 松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬標(biāo)志蛋白BxATG8的誘導(dǎo)表達(dá)與純化
        1.5 松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬標(biāo)志蛋白BxATG8抗體的制備
        1.6 BxATG8 抗體的效價(jià)檢測(cè)與Western blot驗(yàn)證
        1.7 松材線(xiàn)蟲(chóng)細(xì)胞自噬活性的定量測(cè)定
        1.8 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬標(biāo)志蛋白BxATG8原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2 松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬標(biāo)志蛋白BxATG8的誘導(dǎo)表達(dá)與純化
        2.3 BxATG8多克隆抗體的制備與質(zhì)量檢測(cè)
        2.4 松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬活性的定量測(cè)定
    3 討論
第三章 松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16 的克隆與功能分析
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料及其培養(yǎng)
        1.2 松材線(xiàn)蟲(chóng)總RNA的提取和cDNA的合成
        1.3 松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16 編碼區(qū)的克隆
        1.4 松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16 的生物信息學(xué)分析
        1.5 松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬基因BxATG9和BxATG16 的雙鏈RNA干擾
        1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因干擾效率和其他自噬基因的表達(dá)
        1.7 自噬基因沉默后松材線(xiàn)蟲(chóng)細(xì)胞自噬活性的測(cè)定
        1.8 自噬基因沉默后松材線(xiàn)蟲(chóng)形態(tài)的觀察與運(yùn)動(dòng)能力的測(cè)定
        1.9 自噬基因沉默后松材線(xiàn)蟲(chóng)取食速度與繁殖量的測(cè)定
        1.10 離體α-蒎烯脅迫和感染松樹(shù)后的松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬基因表達(dá)量測(cè)定
        1.11 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16 的克隆與測(cè)序
        2.2 松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬蛋白BxATG5、BxATG9和BxATG16 的同源性、理化性質(zhì)及三級(jí)結(jié)構(gòu)分析
        2.3 松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬基因BxATG9和BxATG16 沉默的效率及對(duì)其他自噬基因表達(dá)的影響
        2.4 自噬基因BxATG9和BxATG16 的沉默降低了松材線(xiàn)蟲(chóng)的自噬活性
        2.5 自噬基因BxATG9和BxATG16 的沉默減少了松材線(xiàn)蟲(chóng)的取食和繁殖
        2.6 α-蒎烯脅迫增加了松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16 的表達(dá)水平
        2.7 松材線(xiàn)蟲(chóng)與松樹(shù)互作中自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16 的表達(dá)模式
    3 討論
第四章 細(xì)胞自噬在松材線(xiàn)蟲(chóng)侵染寄主過(guò)程中的作用
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料及其培養(yǎng)
        1.2 松材線(xiàn)蟲(chóng)接種黑松與樣品制備
        1.3 黑松與松材線(xiàn)蟲(chóng)總RNA的提取和cDNA的合成
        1.4 黑松RBOH基因的克隆
        1.5 qRT-PCR
        1.6 黑松莖段H₂O₂含量的測(cè)定
        1.7 氧化脅迫下松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬基因表達(dá)的測(cè)定
        1.8 氧化脅迫下松材線(xiàn)蟲(chóng)細(xì)胞自噬的透射電鏡觀察
        1.9 Western blot檢測(cè)松材線(xiàn)蟲(chóng)的自噬活性
        1.10 自噬抑制劑處理松材線(xiàn)蟲(chóng)與線(xiàn)蟲(chóng)自噬基因的干擾
        1.11 松材線(xiàn)蟲(chóng)形態(tài)觀察與運(yùn)動(dòng)能力的測(cè)定
        1.12 松材線(xiàn)蟲(chóng)取食速度與繁殖量的測(cè)定
        1.13 松材線(xiàn)蟲(chóng)卵孵化率和存活率的測(cè)定
        1.14 松材線(xiàn)蟲(chóng)致病力及其在松樹(shù)體內(nèi)繁殖力測(cè)定
        1.15 松材線(xiàn)蟲(chóng)接種黑松后早期抗氧化相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定
        1.16 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 侵染早期松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬基因表達(dá)與松樹(shù)ROS代謝相關(guān)
        2.2 氧化脅迫誘發(fā)了松材線(xiàn)蟲(chóng)的細(xì)胞自噬
        2.3 抑制自噬減少了松材線(xiàn)蟲(chóng)氧化脅迫下的取食、繁殖、卵孵化和存活
        2.4 抑制自噬降低了松材線(xiàn)蟲(chóng)的毒力
        2.5 自噬基因?qū)λ刹木�(xiàn)蟲(chóng)氧化脅迫下的取食、繁殖、卵孵化和存活是必要的
        2.6 自噬基因?qū)λ刹木�(xiàn)蟲(chóng)的致病力有貢獻(xiàn)
        2.7 抑制自噬提高了侵染早期松材線(xiàn)蟲(chóng)抗氧化基因的表達(dá)
    3 討論
第五章 細(xì)胞自噬在松材線(xiàn)蟲(chóng)響應(yīng)溫度變化過(guò)程中的作用
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料及其培養(yǎng)
        1.2 不同溫度下松材線(xiàn)蟲(chóng)取食速度與繁殖量的測(cè)定
        1.3 不同溫度下松材線(xiàn)蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的測(cè)定
        1.4 不同溫度下松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬活性的檢測(cè)
        1.5 松材線(xiàn)蟲(chóng)總RNA的提取和cDNA的合成
        1.6 不同溫度下松材線(xiàn)蟲(chóng)自噬基因表達(dá)水平的測(cè)定
        1.7 自噬抑制后的松材線(xiàn)蟲(chóng)取食速度、繁殖量與運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定
        1.8 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 溫度變化改變了松材線(xiàn)蟲(chóng)的取食繁殖與運(yùn)動(dòng)能力
        2.2 溫度影響松材線(xiàn)蟲(chóng)的細(xì)胞自噬
        2.3 自噬促進(jìn)松材線(xiàn)蟲(chóng)在低溫下的取食繁殖和運(yùn)動(dòng)能力
    3 討論
第六章 全文總結(jié)與展望
    1 全文總結(jié)
    2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
    3 展望
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與獲獎(jiǎng)情況
參考文獻(xiàn)



本文編號(hào)：3825932