瓜實(shí)蠅Bactrocera cucurbitae(Copuillett)隸屬雙翅目 Diptera,實(shí)蠅科 Tephritidae,果實(shí)蠅屬Bactrocera Macquar,其繁殖力強(qiáng),寄生范圍廣,主要為害葫蘆科和茄科植物,已成為世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要害蟲之一。性別決定是影響瓜實(shí)蠅生殖、發(fā)育的關(guān)鍵因素。transformer(tra)是很多昆蟲性別決定中的一個關(guān)鍵基因,特別是在雙翅目昆蟲中。但迄今為止瓜實(shí)蠅性別決定的分子機(jī)制尚未不清楚,而且瓜實(shí)蠅的transformer尚未得到鑒定。本次研究以瓜實(shí)蠅為試驗(yàn)材料,利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù),分離瓜實(shí)蠅tra(Bcutra)基因,采用半定量RT-PCR方法研究tra基因在瓜實(shí)蠅不同發(fā)育時期的表達(dá)情況,研究該基因在瓜實(shí)蠅性別決定中的可能作用,利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除瓜實(shí)蠅tra基因,為防治瓜實(shí)蠅提供新思路、新方法。在這項(xiàng)研究中,我們從瓜實(shí)蠅tra基因中分離和鑒定得到一個雌性特異轉(zhuǎn)錄本和二個雄性特異轉(zhuǎn)錄本,Bcutra基因的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定,并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在Bcutra中存在多個保守的TRA/TRA-2結(jié)合位點(diǎn)。BcuTRA與其他...

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
搪要
Abstract
1 引言
    1.1 瓜實(shí)蠅簡介
    1.2 昆蟲性別決定
    1.3 CRISPR/Cas9技術(shù)
    1.4 技術(shù)線路
2 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 供試?yán)ハx
        2.1.2 主要儀器設(shè)備
        2.1.3 主要試劑盒和試劑
        2.1.4 部分溶液配制
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 瓜實(shí)蠅的飼養(yǎng)
        2.2.2 Bcutra基因鑒定
        2.2.3 Bcutra基因結(jié)構(gòu)分析
        2.2.4 序列分析與進(jìn)化樹構(gòu)建
        2.2.5 Bcutra不同時間性別發(fā)育表達(dá)分析
        2.2.6 利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除Bcutra基因
3 結(jié)果與分析
    3.1 瓜實(shí)蠅總RNA提取
    3.2 Bcutra基因中間片段的獲得
    3.3 用RACE技術(shù)擴(kuò)增Bcutra基因全長
    3.4 Bcutra基因結(jié)構(gòu)分析
        3.4.1 Bcutra基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增
        3.4.2 Bcutra基因結(jié)構(gòu)和剪接類型
    3.5 瓜實(shí)蠅tra基因生物信息學(xué)分析
        3.5.1 Bcutra核苷酸序列與氨基酸序列
        3.5.2 Bcutra氨基酸序列比對
        3.5.3 TRA系統(tǒng)發(fā)育分析
        3.5.4 BcuTRA氨基酸序列理化性質(zhì)分析與高級結(jié)構(gòu)預(yù)測
    3.6 Bcutra不同發(fā)育時間表達(dá)分析
        3.6.1 RNA提取
        3.6.2 半定量PT-PCR分析Bcutra不同時期的表達(dá)
    3.7 利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除Bcutra基因
        3.7.1 Cas9載體線性化
        3.7.2 Cas9 mRNA合成
        3.7.3 sgRNA體外合成
        3.7.4 構(gòu)建Bcutra基因的靶向編輯模型
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
附件
在讀期間與課題有關(guān)的研究成果



本文編號：3812734