馬鈴薯與演化型IIB青枯菌共同起源于南美,具有悠久的共進化歷史。然而我們對兩者之間的互作機制卻了解甚少。由于馬鈴薯栽培品種缺乏青枯病抗源且對兩者互作關(guān)系的認知不足,馬鈴薯青枯病抗病育種收效甚微。三型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白是青枯菌干擾植物免疫的重要武器,然而目前青枯菌效應(yīng)蛋白的功能研究報道仍舊較少。青枯菌復(fù)合種具有近100個效應(yīng)蛋白家族,因此建立系統(tǒng)的篩選體系來確定研究對象至關(guān)重要�；诖�,我們建立了一個多重篩選系統(tǒng)(馬鈴薯效應(yīng)突變體的毒力篩選,酵母的生長抑制篩選和本氏煙草的瞬時表達篩選)來鑒定馬鈴薯青枯菌的核心效應(yīng)子,為深入效應(yīng)蛋白功能提供更多的研究視角和研究手段,同時我們也對Rip25效應(yīng)蛋白的毒力功能進行了進一步的深入研究,為馬鈴薯青枯病抗病機制提供理論支撐。本研究包括以下幾個方面內(nèi)容:1.演化型IIB青枯菌核心效應(yīng)蛋白的篩選a)我們利用了野生型菌株UW551及其三型分泌系統(tǒng)突變體Δhrc V進行了馬鈴薯接種鑒定。結(jié)果顯示,突變體Δhrc V無法對馬鈴薯植株形成侵染;而且突變體對薯塊的侵染能力也顯著下降。這表明三型分泌系統(tǒng)對馬鈴薯侵染至關(guān)重要。b)我們對13個已測序演化型IIB青枯菌的效...

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【學(xué)位級別】：博士

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摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 前言
    1.1 引言
    1.2 青枯菌的致病機理
        1.2.1 青枯菌的分類
        1.2.2 青枯菌的寄主范圍與生存周期
        1.2.3 青枯菌的致病系統(tǒng)
    1.3 青枯菌抗病研究
        1.3.1 模式植物擬南芥青枯病抗性研究進展
        1.3.2 馬鈴薯青枯病抗性研究概況
    1.4 青枯菌III型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白毒力功能研究進展
        1.4.1 青枯病毒力效應(yīng)蛋白的篩選
        1.4.2 青枯菌效應(yīng)蛋白干擾植物PTI
        1.4.3 青枯菌效應(yīng)蛋白干擾蛋白泛素化
        1.4.4 青枯菌效應(yīng)蛋白與細胞死亡
        1.4.5 青枯菌效應(yīng)蛋白RipAY的研究進展
    1.5 細菌半胱氨酸蛋白類效應(yīng)蛋白的研究進展
        1.5.1 動物病原半胱氨酸蛋白酶效應(yīng)蛋白
        1.5.2 植物病原半胱氨酸蛋白酶效應(yīng)蛋白
    1.6 植物細胞的程序性死亡
        1.6.1 蛋白酶參與的細胞死亡過程
        1.6.2 自噬參與的細胞死亡過程
    1.7 本研究意義內(nèi)容與技術(shù)路線
        1.7.1 研究意義
        1.7.2 研究內(nèi)容
        1.7.3 研究技術(shù)路線
第二章 材料和方法
    2.1 本實驗所用材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 工程菌株
        2.1.3 實驗質(zhì)粒
        2.1.4 本實驗所用的青枯菌
    2.2 生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫
    2.3 分子克隆相關(guān)
        2.3.1 分子克隆所用試劑
        2.3.2 基因克隆及檢測
        2.3.3 點突變的構(gòu)建
    2.4 青枯菌突變體構(gòu)建
        2.4.1 突變體片段構(gòu)建
        2.4.2 青枯菌轉(zhuǎn)化
        2.4.3 超量表達Rip25 青枯菌構(gòu)建
        2.4.4 青枯菌運動性測定
    2.5 馬鈴薯青枯病抗性鑒定
        2.5.1 馬鈴薯植株接種鑒定
        2.5.2 馬鈴薯薯塊接種實驗
    2.6 酵母菌的轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達
    2.7 酵母生長抑制篩選
    2.8 煙草瞬時表達相關(guān)
        2.8.1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
        2.8.2 煙草細胞瞬時表達
        2.8.3 細胞死亡統(tǒng)計
    2.9 蛋白免疫印跡
    2.10 免疫沉淀質(zhì)譜鑒定
    2.11 共聚焦顯微鏡觀察亞細胞結(jié)構(gòu)
    2.12 病毒誘導(dǎo)的基因沉默
        2.12.1 本課題所沉默的基因信息
        2.12.2 TRV介導(dǎo)的基因沉默
        2.12.3 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄
        2.12.4 RT-PCR
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 演化型 IIB 青枯菌核心效應(yīng)蛋白的篩選
        3.1.1 三型分泌系統(tǒng)對馬鈴薯青枯菌致病的作用
        3.1.2 青枯菌 UW551 效應(yīng)蛋白家族的核心生物信息分析
        3.1.3 核心效應(yīng)蛋白突變體的構(gòu)建與毒力篩選
        3.1.4 核心效應(yīng)蛋白的酵母生長抑制篩選
        3.1.5 效應(yīng)蛋白煙草瞬時表達表型與亞細胞定位
        3.1.6 核心效應(yīng)蛋白篩選結(jié)果匯總
    3.2 Rip25 效應(yīng)蛋白毒力功能的研究
        3.2.1 Rip25 效應(yīng)蛋白是一個促進馬鈴薯致病的毒力蛋白
        3.2.2 Rip25 在煙草中能形成細胞死亡并能夠抑制酵母生長
        3.2.3 Rip25 具有半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)和錨定蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域
        3.2.4 N端酶活中心與C端錨蛋白重復(fù)區(qū)的對毒力表型具有重要作用
        3.2.5 Rip25 蛋白在煙草和酵母表達下N端具有自切割活性
        3.2.6 Rip25 的錨定蛋白重復(fù)序列參與了蛋白切割位點識別
    3.3 Rip25 細胞死亡信號通路的研究
        3.3.1 沉默免疫相關(guān)基因無法干擾Rip25 介導(dǎo)的細胞死亡
        3.3.2 Rip25 在煙草細胞產(chǎn)生的細胞死亡過程伴隨細胞自噬
        3.3.3 沉默細胞自噬相關(guān)基因不能干擾Rip25 的細胞死亡
第四章 討論
    4.1 酵母細胞中StHMO1 回補Rip25 介導(dǎo)酵母抑制生長
    4.2 Rip25具有低溫酶活適應(yīng)性
    4.3 Rip6與 Rip25的毒力機制的異同
    4.4 三種效應(yīng)蛋白篩選方法具有不同的優(yōu)勢
    4.5 未知功能的細菌效應(yīng)蛋白研究策略
    4.6 Rip25 蛋白酶自切割的作用
    4.7 錨定蛋白重復(fù)序列的功能
    4.8 Rip25 介導(dǎo)細胞死亡機制
參考文獻
附錄一 本研究所用質(zhì)粒菌株及引物
附錄二 抑制子酵母篩選文庫篩選結(jié)果
附錄三 讀博期間發(fā)表文章
致謝



本文編號：3810548