性信息素結(jié)合蛋白(Pheromone binding proteins,PBPs)在鱗翅目昆蟲性信息素感受中起重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn),夜蛾科昆蟲至少含有3個(gè)不同的PBP基因,但對(duì)于其功能分化及在性信息素感受中的相對(duì)重要性缺乏活體研究。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)源于細(xì)菌和古細(xì)菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種獲得性免疫機(jī)制,通過人工的改造,目前已成功的運(yùn)用于多種生物,成為一種方便高效的基因功能研究工具。本研究以多食性夜蛾科害蟲斜紋夜蛾為對(duì)象,首次利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)3個(gè)PBP基因分別進(jìn)行敲除并獲得相應(yīng)的純合突變品系,然后利用電生理和行為測定技術(shù)闡述了斜紋夜蛾3個(gè)不同PBP基因在性信息素感受中的功能及相對(duì)重要性,研究結(jié)果對(duì)于明確夜蛾科昆蟲性信息素分子感受機(jī)制及設(shè)計(jì)和開發(fā)更為高效的基于嗅覺的害蟲防控技術(shù)有重要意義。此外還克隆了斜紋夜蛾的BLOS2基因,利用CRISPR/Cas9技術(shù)明確了其在幼蟲表皮顏色形成中的決定性作用,為斜紋夜蛾及其他夜蛾類昆蟲的基因工程研究提供一個(gè)重要的標(biāo)記基因。本研究同時(shí)為斜紋夜蛾及其他鱗翅目害蟲的基因編輯提供了重要技術(shù)參考。主要研究結(jié)果如下:1.運(yùn)用CRISPR/...

【文章頁數(shù)】：150 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 CRISPR/CAS系統(tǒng)介紹
        1.1.1 研究歷史
        1.1.2 結(jié)構(gòu)和組成
            1.1.2.1 CRISPR結(jié)構(gòu)
            1.1.2.2 Cas基因
            1.1.2.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)
        1.1.3 作用機(jī)制
    1.2 CRISPR/CAS9系統(tǒng)
        1.2.1 研究現(xiàn)狀
        1.2.2 昆蟲研究中的應(yīng)用
    1.3 昆蟲嗅覺機(jī)制研究進(jìn)展
        1.3.1 昆蟲嗅覺的一般過程
        1.3.2 昆蟲氣味結(jié)合蛋白
        1.3.3 鱗翅目昆蟲性信息素結(jié)合蛋白
    1.4 昆蟲BLOS2基因研究進(jìn)展
    1.5 本研究的目的和意義
第二章 斜紋夜蛾P(guān)BP1基因的敲除及功能分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.1.1 供試?yán)ハx
        2.1.2 主要儀器設(shè)備
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 靶標(biāo)位點(diǎn)的選擇
        2.1.5 sgRNA和Cas9 mRNA的體外轉(zhuǎn)錄合成
            2.1.5.1 sgRNA轉(zhuǎn)錄模板的制備
            2.1.5.2 sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄
            2.1.5.3 Cas9 mRNA體外轉(zhuǎn)錄合成
        2.1.6 卵的顯微注射及突變檢測
            2.1.6.1 顯微注射
            2.1.6.2 突變檢測
        2.1.7 脫靶效應(yīng)的檢測
        2.1.8 純合突變品系的選育
        2.1.9 Western-blot檢測
        2.1.10 觸角電位(EAG)的測定
        2.1.11 行為學(xué)和Y型嗅覺儀檢測
        2.1.12 觸角轉(zhuǎn)錄組測序
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 PBP1基因的敲除
        2.2.2 突變品系的選育
        2.2.3 脫靶檢測
        2.2.4 Westen-blot雜交檢測
        2.2.5 PBP1突變品系對(duì)性信息素組分的EAG反應(yīng)
        2.2.6 PBP1突變品系行為反應(yīng)測定
        2.2.7 PBP1突變品系RNA-seq分析
            2.2.7.1 兩個(gè)品系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)概況
            2.2.7.2 兩個(gè)品系差異基因的數(shù)量
            2.2.7.3 兩個(gè)品系差異基因的KEGG通路分析
            2.2.7.4 兩個(gè)品系差異基因的COG分析
    2.3 討論
第三章 斜紋夜蛾P(guān)BP2和PBP3基因的敲除及功能分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 供試?yán)ハx
        3.1.2 主要試劑與設(shè)備
        3.1.3 靶標(biāo)位點(diǎn)的選擇
        3.1.4 sgRNA和Cas9 mRNA的體外合成
        3.1.5 卵的顯微注射及突變檢測
        3.1.6 純合突變品系的選育
        3.1.7 脫靶效應(yīng)的檢測
        3.1.8 觸角電位(EAG)測定
        3.1.9 行為測定
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 PBP2和PBP3基因的敲除
        3.2.2 突變品系的篩選
        3.2.3 脫靶檢測
        3.2.4 突變品系對(duì)性信息素組分的EAG反應(yīng)
        3.2.5 PBP2突變品系行為反應(yīng)測定
    3.3 討論
第四章 斜紋夜蛾BLOS2基因的克隆及功能分析
    4.1 材料與方法
        4.1.1 供試?yán)ハx
        4.1.2 主要試劑與設(shè)備
        4.1.3 BLOS2基因的克隆與序列分析
            4.1.3.1 總RNA和基因組DNA的提取及cDNA第一鏈的合成
            4.1.3.2 RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得BLOS2基因的cDNA全長
            4.1.3.3 PCR擴(kuò)增BLOS2基因的基因組全長
            4.1.3.4 BLOS2基因的系統(tǒng)發(fā)育分析
            4.1.3.5 BLOS2基因時(shí)間表達(dá)動(dòng)態(tài)測定
    4.2 CRISPR/CAS9對(duì)BLOS2基因功能的分析
        4.2.1 sgRNA靶標(biāo)位點(diǎn)的選擇
        4.2.2 sgRNA和Cas9 mRNA的體外轉(zhuǎn)錄合成
        4.2.3 顯微注射
        4.2.4 突變體觀察與分析
        4.2.5 脫靶分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 BLOS2基因的克隆和序列分析
        4.3.2 BLOS2基因的時(shí)間動(dòng)態(tài)表達(dá)
        4.3.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除BLOS2基因
        4.3.4 純合突變體的選育
        4.3.5 脫靶分析
    4.4 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
攻讀博士期間學(xué)術(shù)論文的發(fā)表及參加學(xué)術(shù)會(huì)議
致謝



本文編號(hào)：3792728