甜瓜(Cucumis melo L.)是我國(guó)最重要的葫蘆科作物之一,栽培廣泛,具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。為害甜瓜的病害多達(dá)數(shù)十種,其中真菌病害最為普遍,侵染的真菌種類也較多,而且仍然存在新突發(fā)病害。本文鑒定一種甜瓜葉斑病,研究該病菌的生物學(xué)特性,篩選針對(duì)該病菌的殺菌劑,以期指導(dǎo)該病害的防控;同時(shí)應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法,創(chuàng)建該病菌的突變體庫(kù),為致病基因研究奠定基礎(chǔ)。取得的主要研究結(jié)果如下:1、甜瓜棒孢葉斑病菌鑒定2015年10月在我國(guó)廣西武鳴甜瓜主要種植區(qū)進(jìn)行病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)一種葉斑病。將病樣分離病原真菌,通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、多基因鑒定和致病性試驗(yàn)鑒定病原菌。在PDA平板上,病原菌菌落圓形,中間墨綠色,邊緣淺褐色,氣生菌絲茂盛。分生孢子呈圓柱形或倒棍棒形,單生或串生,直立或稍微彎曲,具0-13個(gè)隔膜,大小為3.1-6.4×14-138.9μm。通過(guò)克隆并測(cè)定該菌的4個(gè)保守序列ITS1,2、ITS4,5、ACT和TUB2,說(shuō)明該菌為多主棒孢。甜瓜葉片上分離純化的病原菌回接到甜瓜幼苗,表現(xiàn)出與病害調(diào)查時(shí)田間相似的癥狀并再次分離到同一病原菌。該菌通常危害植物葉片引起葉斑病,寄主廣泛。接種該病原菌的西瓜(Cit...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 多主棒孢的研究進(jìn)展
        1.1.1 多主棒孢的分類地位和特征
        1.1.2 多主棒孢的寄主范圍及危害
        1.1.3 多主棒孢葉斑病的防治
    1.2 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展
        1.2.1 ATMT技術(shù)在真菌上的應(yīng)用與發(fā)展
        1.2.2 根癌農(nóng)桿菌及其介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化
        1.2.3 ATMT相對(duì)于其他轉(zhuǎn)化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)
        1.2.4 ATMT技術(shù)在真菌中的研究趨勢(shì)
        1.2.5 ATMT技術(shù)存在的問(wèn)題和局限
        1.2.6 ATMT技術(shù)的未來(lái)及在真菌中的進(jìn)一步應(yīng)用
    1.3 本研究的目的和意義
第二章 甜瓜棒孢葉斑病菌鑒定
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 供試菌株
        2.2.2 試驗(yàn)試劑
        2.2.3 供試培養(yǎng)基
        2.2.4 儀器設(shè)備
        2.2.5 試驗(yàn)方法
            2.2.5.1 甜瓜棒孢葉斑病的標(biāo)本采集
            2.2.5.2 病原菌的分離及純化
            2.2.5.3 病原菌菌落形態(tài)觀察
            2.2.5.4 病原菌分生孢子形態(tài)觀察
            2.2.5.5 甜瓜棒孢葉斑病菌菌絲DNA提取
            2.2.5.6 DNA提取質(zhì)量和濃度檢測(cè)
            2.2.5.7 甜瓜棒孢葉斑病菌的分子鑒定
            2.2.5.8 甜瓜棒孢葉斑病菌致病性測(cè)定
            2.2.5.9 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響
            2.2.5.10 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響
            2.2.5.11 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響
            2.2.5.12 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響
            2.2.5.13 病原菌分生孢子的萌發(fā)規(guī)律和方式
            2.2.5.14 pH對(duì)孢子萌發(fā)的影響
            2.2.5.15 碳源對(duì)孢子萌發(fā)的影響
            2.2.5.16 培養(yǎng)基種類對(duì)產(chǎn)孢的影響
            2.2.5.17 不同殺菌劑對(duì)甜瓜棒孢葉斑病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定
            2.2.5.18 數(shù)據(jù)處理
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 甜瓜棒孢葉斑病的田間癥狀
        2.3.2 甜瓜棒孢葉斑病菌菌落形態(tài)
        2.3.3 甜瓜棒孢葉斑病菌顯微形態(tài)
        2.3.4 甜瓜棒孢葉斑病菌菌絲DNA提取質(zhì)量和濃度
        2.3.5 甜瓜棒孢葉斑病菌分子鑒定
        2.3.6 甜瓜棒孢葉斑病菌致病性測(cè)定
        2.3.7 溫度對(duì)Cc-12 菌株生長(zhǎng)的影響
        2.3.8 pH對(duì) Cc-12 菌株生長(zhǎng)的影響
        2.3.9 碳源對(duì)Cc-12 菌株生長(zhǎng)的影響
        2.3.10 氮源對(duì)Cc-12 菌株生長(zhǎng)的影響
        2.3.11 Cc-12 菌株分生孢子萌發(fā)規(guī)律和特點(diǎn)
        2.3.12 pH對(duì)孢子萌發(fā)的影響
        2.3.13 碳源對(duì)孢子萌發(fā)的影響
        2.3.14 培養(yǎng)基種類對(duì)產(chǎn)孢的影響
        2.3.15 22種殺菌劑對(duì)甜瓜棒孢葉斑病菌Cc-SY菌株的室內(nèi)毒力比較
        2.3.16 22種殺菌劑對(duì)甜瓜棒孢葉斑病菌Cc-12 菌株的室內(nèi)毒力比較
    2.4 討論
第三章 甜瓜棒孢葉斑病菌全基因組測(cè)序
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 試驗(yàn)材料
        3.2.2 試驗(yàn)方法
            3.2.2.1 甜瓜棒孢葉斑病菌菌絲DNA提取
            3.2.2.2 建庫(kù)測(cè)序和組裝
            3.2.2.3 基因組注釋
            3.2.2.4 比較基因組分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 基因組測(cè)序及組裝
            3.3.1.1 二代數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)
            3.3.1.2 17-mer分析及基因組大小估計(jì)
            3.3.1.3 三代組裝數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)
            3.3.1.4 基因組組裝結(jié)果
            3.3.1.5 線粒體組裝結(jié)果
            3.3.1.6 基因組組裝評(píng)估
            3.3.1.7 單堿基深度統(tǒng)計(jì)圖
            3.3.1.8 GC含量及深度分布分析
        3.3.2 基因組注釋
            3.3.2.1 重復(fù)序列注釋
            3.3.2.2 基因注釋
        3.3.3 基因功能注釋
            3.3.3.1 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋
            3.3.3.2 GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋
            3.3.3.3 Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)注釋
            3.3.3.4 NR數(shù)據(jù)庫(kù)注釋
            3.3.3.5 eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋
            3.3.3.6 KOG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋
        3.3.4 非編碼RNA注釋
        3.3.5 比較基因組分析
            3.3.5.1 基因家族鑒定
            3.3.5.2 系統(tǒng)發(fā)育分析
            5.3.5.3 分化時(shí)間估算
            3.3.5.4 基因家族擴(kuò)張和收縮分析
            3.3.5.5 基因組共線性分析
        3.3.6 病原真菌致病性研究
            3.3.6.1 病原與宿主互作(PHI)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋
            3.3.6.2 碳水化合物注釋
            3.3.6.3 細(xì)胞色素P450 數(shù)據(jù)庫(kù)(CYPs)注釋
            3.3.6.4 分泌蛋白預(yù)測(cè)
            3.3.6.5 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白注釋
            3.3.6.6 轉(zhuǎn)錄因子注釋
            3.3.6.7 次級(jí)代謝產(chǎn)物注釋
    3.4 討論
第四章 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜棒孢葉斑病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 菌株及質(zhì)粒
        4.2.2 供試培養(yǎng)基
        4.2.3 試劑及耗材
        4.2.4 主要儀器設(shè)備
        4.2.5 試驗(yàn)方法
            4.2.5.1 質(zhì)粒提取
            4.2.5.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌
            4.2.5.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
            4.2.5.4 Cc-12 菌株對(duì)潮霉素的敏感性
            4.2.5.5 Cef抑制農(nóng)桿菌正常生長(zhǎng)的濃度篩選
            4.2.5.6 Tim抑制農(nóng)桿菌正常生長(zhǎng)的濃度篩選
            4.2.5.7 Cc-12 菌株對(duì)抗生素的敏感性
            4.2.5.8 分生孢子的制備
            4.2.5.9 根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的制備
            4.2.5.10 根癌農(nóng)桿菌與多主棒孢菌共培養(yǎng)
            4.2.5.11 轉(zhuǎn)化子篩選
            4.2.5.12 pH對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響
            4.2.5.13 共培養(yǎng)溫度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響
            4.2.5.14 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響
            4.2.5.15 根癌農(nóng)桿菌濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響
            4.2.5.16 Ca²⁺濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響
            4.2.5.17 Cc-12 轉(zhuǎn)化子基因組DNA的提取
            4.2.5.18 Cc-12 轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定
            4.2.5.19 Southern blot檢測(cè)突變體的T-DNA插入拷貝數(shù)
            4.2.5.20 Cc-12 轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性分析
            4.2.5.21 表型變異突變體篩選
            4.2.5.22 致病性變異突變體篩選
            4.2.5.23 熱不對(duì)稱PCR
            4.2.5.24 重組質(zhì)粒的篩選
            4.2.5.25 轉(zhuǎn)化子完整T-DNA的擴(kuò)增
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 質(zhì)粒提取
        4.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
        4.3.3 Cc-12 菌株對(duì)潮霉素的敏感性
        4.3.4 抑制農(nóng)桿菌正常生長(zhǎng)的Cef濃度篩選
        4.3.5 抑制農(nóng)桿菌正常生長(zhǎng)的Tim濃度篩選
        4.3.6 Cc-12 菌株對(duì)抗生素的敏感性
        4.3.7 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜棒孢葉斑病菌遺傳轉(zhuǎn)化
        4.3.8 Cc-12 轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(cè)
        4.3.9 Southern blot檢測(cè)Cc-12 轉(zhuǎn)化子的T-DNA插入拷貝數(shù)
        4.3.10 Cc-12 轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性
        4.3.11 甜瓜棒孢葉斑病菌Cc-12 菌株轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)特征比較
        4.3.12 表型變異突變體致病性測(cè)定
        4.3.13 致病性變異突變體Southern blot雜交分析
        4.3.14 T-DNA插入側(cè)翼序列擴(kuò)增
        4.3.15 T-DNA插入側(cè)翼序列分析
        4.3.16 轉(zhuǎn)化子完整T-DNA的擴(kuò)增
    4.4 討論
第五章 結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ 部分代表性轉(zhuǎn)化菌株的菌落形態(tài)
附錄Ⅱ 表型變異突變體致病性測(cè)定(使用孢子)
附錄Ⅲ 表型變異突變體致病性測(cè)定(使用菌塊)
附錄Ⅳ 作者簡(jiǎn)介
致謝



本文編號(hào)：3792247