甜瓜(Cucumis melo L.)是我國最重要的葫蘆科作物之一,栽培廣泛,具有重要的經濟價值。為害甜瓜的病害多達數(shù)十種,其中真菌病害最為普遍,侵染的真菌種類也較多,而且仍然存在新突發(fā)病害。本文鑒定一種甜瓜葉斑病,研究該病菌的生物學特性,篩選針對該病菌的殺菌劑,以期指導該病害的防控;同時應用農桿菌介導方法,創(chuàng)建該病菌的突變體庫,為致病基因研究奠定基礎。取得的主要研究結果如下:1、甜瓜棒孢葉斑病菌鑒定2015年10月在我國廣西武鳴甜瓜主要種植區(qū)進行病害調查時發(fā)現(xiàn)一種葉斑病。將病樣分離病原真菌,通過形態(tài)學觀察、多基因鑒定和致病性試驗鑒定病原菌。在PDA平板上,病原菌菌落圓形,中間墨綠色,邊緣淺褐色,氣生菌絲茂盛。分生孢子呈圓柱形或倒棍棒形,單生或串生,直立或稍微彎曲,具0-13個隔膜,大小為3.1-6.4×14-138.9μm。通過克隆并測定該菌的4個保守序列ITS1,2、ITS4,5、ACT和TUB2,說明該菌為多主棒孢。甜瓜葉片上分離純化的病原菌回接到甜瓜幼苗,表現(xiàn)出與病害調查時田間相似的癥狀并再次分離到同一病原菌。該菌通常危害植物葉片引起葉斑病,寄主廣泛。接種該病原菌的西瓜(Cit...

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【學位級別】：博士

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摘要
Abstract
縮略表
第一章 文獻綜述
    1.1 多主棒孢的研究進展
        1.1.1 多主棒孢的分類地位和特征
        1.1.2 多主棒孢的寄主范圍及危害
        1.1.3 多主棒孢葉斑病的防治
    1.2 根癌農桿菌介導絲狀真菌遺傳轉化研究進展
        1.2.1 ATMT技術在真菌上的應用與發(fā)展
        1.2.2 根癌農桿菌及其介導的真菌遺傳轉化
        1.2.3 ATMT相對于其他轉化技術的優(yōu)點
        1.2.4 ATMT技術在真菌中的研究趨勢
        1.2.5 ATMT技術存在的問題和局限
        1.2.6 ATMT技術的未來及在真菌中的進一步應用
    1.3 本研究的目的和意義
第二章 甜瓜棒孢葉斑病菌鑒定
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 供試菌株
        2.2.2 試驗試劑
        2.2.3 供試培養(yǎng)基
        2.2.4 儀器設備
        2.2.5 試驗方法
            2.2.5.1 甜瓜棒孢葉斑病的標本采集
            2.2.5.2 病原菌的分離及純化
            2.2.5.3 病原菌菌落形態(tài)觀察
            2.2.5.4 病原菌分生孢子形態(tài)觀察
            2.2.5.5 甜瓜棒孢葉斑病菌菌絲DNA提取
            2.2.5.6 DNA提取質量和濃度檢測
            2.2.5.7 甜瓜棒孢葉斑病菌的分子鑒定
            2.2.5.8 甜瓜棒孢葉斑病菌致病性測定
            2.2.5.9 溫度對菌絲生長的影響
            2.2.5.10 pH對菌絲生長的影響
            2.2.5.11 碳源對菌絲生長的影響
            2.2.5.12 氮源對菌絲生長的影響
            2.2.5.13 病原菌分生孢子的萌發(fā)規(guī)律和方式
            2.2.5.14 pH對孢子萌發(fā)的影響
            2.2.5.15 碳源對孢子萌發(fā)的影響
            2.2.5.16 培養(yǎng)基種類對產孢的影響
            2.2.5.17 不同殺菌劑對甜瓜棒孢葉斑病菌的室內毒力測定
            2.2.5.18 數(shù)據(jù)處理
    2.3 結果與分析
        2.3.1 甜瓜棒孢葉斑病的田間癥狀
        2.3.2 甜瓜棒孢葉斑病菌菌落形態(tài)
        2.3.3 甜瓜棒孢葉斑病菌顯微形態(tài)
        2.3.4 甜瓜棒孢葉斑病菌菌絲DNA提取質量和濃度
        2.3.5 甜瓜棒孢葉斑病菌分子鑒定
        2.3.6 甜瓜棒孢葉斑病菌致病性測定
        2.3.7 溫度對Cc-12 菌株生長的影響
        2.3.8 pH對 Cc-12 菌株生長的影響
        2.3.9 碳源對Cc-12 菌株生長的影響
        2.3.10 氮源對Cc-12 菌株生長的影響
        2.3.11 Cc-12 菌株分生孢子萌發(fā)規(guī)律和特點
        2.3.12 pH對孢子萌發(fā)的影響
        2.3.13 碳源對孢子萌發(fā)的影響
        2.3.14 培養(yǎng)基種類對產孢的影響
        2.3.15 22種殺菌劑對甜瓜棒孢葉斑病菌Cc-SY菌株的室內毒力比較
        2.3.16 22種殺菌劑對甜瓜棒孢葉斑病菌Cc-12 菌株的室內毒力比較
    2.4 討論
第三章 甜瓜棒孢葉斑病菌全基因組測序
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 試驗材料
        3.2.2 試驗方法
            3.2.2.1 甜瓜棒孢葉斑病菌菌絲DNA提取
            3.2.2.2 建庫測序和組裝
            3.2.2.3 基因組注釋
            3.2.2.4 比較基因組分析
    3.3 結果與分析
        3.3.1 基因組測序及組裝
            3.3.1.1 二代數(shù)據(jù)量統(tǒng)計
            3.3.1.2 17-mer分析及基因組大小估計
            3.3.1.3 三代組裝數(shù)據(jù)量統(tǒng)計
            3.3.1.4 基因組組裝結果
            3.3.1.5 線粒體組裝結果
            3.3.1.6 基因組組裝評估
            3.3.1.7 單堿基深度統(tǒng)計圖
            3.3.1.8 GC含量及深度分布分析
        3.3.2 基因組注釋
            3.3.2.1 重復序列注釋
            3.3.2.2 基因注釋
        3.3.3 基因功能注釋
            3.3.3.1 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋
            3.3.3.2 GO數(shù)據(jù)庫注釋
            3.3.3.3 Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫注釋
            3.3.3.4 NR數(shù)據(jù)庫注釋
            3.3.3.5 eggNOG數(shù)據(jù)庫注釋
            3.3.3.6 KOG數(shù)據(jù)庫注釋
        3.3.4 非編碼RNA注釋
        3.3.5 比較基因組分析
            3.3.5.1 基因家族鑒定
            3.3.5.2 系統(tǒng)發(fā)育分析
            5.3.5.3 分化時間估算
            3.3.5.4 基因家族擴張和收縮分析
            3.3.5.5 基因組共線性分析
        3.3.6 病原真菌致病性研究
            3.3.6.1 病原與宿主互作(PHI)數(shù)據(jù)庫注釋
            3.3.6.2 碳水化合物注釋
            3.3.6.3 細胞色素P450 數(shù)據(jù)庫(CYPs)注釋
            3.3.6.4 分泌蛋白預測
            3.3.6.5 轉運蛋白注釋
            3.3.6.6 轉錄因子注釋
            3.3.6.7 次級代謝產物注釋
    3.4 討論
第四章 根癌農桿菌介導的甜瓜棒孢葉斑病菌遺傳轉化體系的建立
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 菌株及質粒
        4.2.2 供試培養(yǎng)基
        4.2.3 試劑及耗材
        4.2.4 主要儀器設備
        4.2.5 試驗方法
            4.2.5.1 質粒提取
            4.2.5.2 質粒轉入大腸桿菌
            4.2.5.3 質粒轉入農桿菌
            4.2.5.4 Cc-12 菌株對潮霉素的敏感性
            4.2.5.5 Cef抑制農桿菌正常生長的濃度篩選
            4.2.5.6 Tim抑制農桿菌正常生長的濃度篩選
            4.2.5.7 Cc-12 菌株對抗生素的敏感性
            4.2.5.8 分生孢子的制備
            4.2.5.9 根癌農桿菌細胞的制備
            4.2.5.10 根癌農桿菌與多主棒孢菌共培養(yǎng)
            4.2.5.11 轉化子篩選
            4.2.5.12 pH對轉化效率的影響
            4.2.5.13 共培養(yǎng)溫度對轉化效率的影響
            4.2.5.14 共培養(yǎng)時間對轉化效率的影響
            4.2.5.15 根癌農桿菌濃度對轉化效率的影響
            4.2.5.16 Ca²⁺濃度對轉化效率的影響
            4.2.5.17 Cc-12 轉化子基因組DNA的提取
            4.2.5.18 Cc-12 轉化子的PCR鑒定
            4.2.5.19 Southern blot檢測突變體的T-DNA插入拷貝數(shù)
            4.2.5.20 Cc-12 轉化子的遺傳穩(wěn)定性分析
            4.2.5.21 表型變異突變體篩選
            4.2.5.22 致病性變異突變體篩選
            4.2.5.23 熱不對稱PCR
            4.2.5.24 重組質粒的篩選
            4.2.5.25 轉化子完整T-DNA的擴增
    4.3 結果與分析
        4.3.1 質粒提取
        4.3.2 質粒轉入農桿菌
        4.3.3 Cc-12 菌株對潮霉素的敏感性
        4.3.4 抑制農桿菌正常生長的Cef濃度篩選
        4.3.5 抑制農桿菌正常生長的Tim濃度篩選
        4.3.6 Cc-12 菌株對抗生素的敏感性
        4.3.7 根癌農桿菌介導的甜瓜棒孢葉斑病菌遺傳轉化
        4.3.8 Cc-12 轉化子的PCR檢測
        4.3.9 Southern blot檢測Cc-12 轉化子的T-DNA插入拷貝數(shù)
        4.3.10 Cc-12 轉化子的遺傳穩(wěn)定性
        4.3.11 甜瓜棒孢葉斑病菌Cc-12 菌株轉化子菌落形態(tài)特征比較
        4.3.12 表型變異突變體致病性測定
        4.3.13 致病性變異突變體Southern blot雜交分析
        4.3.14 T-DNA插入側翼序列擴增
        4.3.15 T-DNA插入側翼序列分析
        4.3.16 轉化子完整T-DNA的擴增
    4.4 討論
第五章 結論與展望
參考文獻
附錄Ⅰ 部分代表性轉化菌株的菌落形態(tài)
附錄Ⅱ 表型變異突變體致病性測定(使用孢子)
附錄Ⅲ 表型變異突變體致病性測定(使用菌塊)
附錄Ⅳ 作者簡介
致謝



本文編號：3792247