發(fā)布時間：2023-03-11 00:16

　　水稻白葉枯病是一種世界性水稻細菌性病害,對水稻生產(chǎn)以及糧食的安全都造成了嚴重危害,因此對水稻抗病相關機制的研究尤為重要。本實驗室前期已證明了OsmiR1858a超表達株系顯著提高了對白葉枯病的抗性,它的剪切靶基因為OsHIN1(Harpin-induced 1 domain containing protein),超表達OsHIN1的水稻植株減弱了對白葉枯的抗性,而RNAi和敲除突變體則正好相反。這些結(jié)果證明OsHIN1負調(diào)控水稻對白葉枯病的抗性,但機制不詳。因此,對OsHIN1負調(diào)控水稻抗白葉枯病的機制進行探索非常必要。OsHIN1為未知功能蛋白,為了明確它可能的作用網(wǎng)絡,擬通過鑒定OsHIN1表達特點、亞細胞定位與鑒定它的互作蛋白,為闡明OsHIN1負調(diào)控水稻白葉枯病中的機制提供線索。主要研究結(jié)果如下:(1)克隆2kb OsHIN1啟動子,構(gòu)建了pOsHIN1::GUS表達載體并遺傳轉(zhuǎn)化水稻,經(jīng)PCR檢測篩選獲得12株獨立轉(zhuǎn)基因株系(已經(jīng)獲得T1代種子)。對轉(zhuǎn)基因水稻GUS染色結(jié)果表明,GUS在水稻幼嫩部位表達較多,成熟部位較少;在葉節(jié)點、根莖結(jié)合部、根毛等分生組織旺盛部位發(fā)現(xiàn)強的...

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫說明
第一章 文獻綜述
    1 水稻白葉枯病概述
    2 水稻白葉枯病抗性基因研究進展
        2.1 水稻抗白葉枯病主效基因研究進展
            2.1.1 NBS-LRR類
            2.1.2 LRR-RLK類
            2.1.3 細胞壁相關激酶類
            2.1.4 隱性基因類
            2.1.5 Executor R基因類
        2.2 水稻感白葉枯病主效基因研究進展
            2.2.1 OsSWEET11和OsSWEET13
            2.2.2 OsSWEET14
            2.2.3 OsSWEET12和OsSWEET15
        2.3 水稻抗白葉枯病微效基因研究進展
            2.3.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子類
            2.3.2 MAPK基因家族
            2.3.3 免疫反應相關類
            2.3.4 miRNA
    3 水稻感白葉枯病機理研究
    4 水稻抗白葉枯病資源挖掘策略
    5 鑒定互作蛋白對抗病機理研究的作用
    6 研究意義及技術路線
        6.1 研究目的及意義
        6.2 技術路線
第二章 OsHIN1的器官表達
    1 前言
    2 材料與試劑
        2.1 實驗材料
        2.2 試劑與菌株
    3 實驗方法
        3.1 pOsHIN1::GUS載體的構(gòu)建
            3.1.1 引物的設計
            3.1.2 目的片段的擴增
            3.1.3 載體的酶切
            3.1.4 目的片段及載體回收
            3.1.5 連接與轉(zhuǎn)化
            3.1.6 載體的驗證與保存
        3.2 農(nóng)桿菌EHA105的轉(zhuǎn)化
            3.2.1 農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞的制備
            3.2.2 表達載體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
            3.2.3 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的鑒定及菌液保存
        3.3 水稻遺傳轉(zhuǎn)化
            3.3.1 水稻愈傷組織的誘導
            3.3.2 愈傷組織的繼代
            3.3.3 農(nóng)桿菌培養(yǎng)
            3.3.4 愈傷組織的侵染和共培養(yǎng)
            3.3.5 脫菌和篩選
            3.3.6 分化
            3.3.7 生根及煉苗
        3.4 pOsHIN1::GUS轉(zhuǎn)基因苗的驗證
            3.4.1 基因組DNA的提取
            3.4.2 PCR驗證
        3.5 GUS染色
            3.5.1 水稻白葉枯菌P6的培養(yǎng)
            3.5.2 水稻白葉枯菌的接種
            3.5.3 GUS染色
    4 結(jié)果與分析
        4.1 pOsHIN1::GUS的載體構(gòu)建
        4.2 pOsHIN1::GUS遺傳轉(zhuǎn)化
        4.3 GUS染色
    5 討論
第三章 OsHIN1的亞細胞定位
    1 前言
    2 材料與試劑
    3 實驗方法
        3.1 高純度質(zhì)粒提取
        3.2 水稻原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化
    4 結(jié)果分析
    5 討論
第四章 OsHIN1互作蛋白的篩選
    1 前言
    2 材料與試劑
        2.1 材料
        2.2 試劑和菌株
    3 實驗方法
        3.1 35S::eGFP(ATG)和35S::OsHIN1:eGFP載體的構(gòu)建
            3.1.1 引物的設計
            3.1.2 目的片段的擴增
            3.1.3 載體的酶切
            3.1.4 目的片段及載體回收
            3.1.5 連接與轉(zhuǎn)化
            3.1.6 載體的驗證與保存
        3.2 農(nóng)桿菌EHα105的轉(zhuǎn)化
        3.3 水稻遺傳轉(zhuǎn)化
        3.4 35S::eGFP和35S::OsHIN1:eGFP轉(zhuǎn)基因苗的驗證
        3.5 酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建及篩選
            3.5.1 水稻幼苗的培養(yǎng)
            3.5.2 水稻白葉枯菌P6的培養(yǎng)
            3.5.3 水稻白葉枯菌P6的接種
            3.5.4 樣品的取送
    4 結(jié)果與分析
        4.1 載體構(gòu)建結(jié)果
        4.2 遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果
        4.3 酵母篩庫結(jié)果
    5 討論
第五章 OsHIN1互作蛋白的鑒定
    1 前言
    2 實驗材料
        2.1 試劑與菌株
        2.2 材料與載體
    3 實驗方法
        3.1 片段式酵母點對點驗證
        3.2 互作蛋白各基因CDS序列的克隆
            3.2.1 水稻總RNA的提取
            3.2.2 cDNA一鏈的合成
            3.2.3 基因序列的克隆
        3.3 雙分子熒光互補載體構(gòu)建
        3.4 酵母雙雜交載體構(gòu)建
        3.5 雙分子熒光互補驗證
            3.5.1 BiFC載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101
            3.5.2 煙草注射
        3.6 酵母雙雜交(全長)驗證
            3.6.1 載體的自激活驗證
            3.6.2 酵母雙雜交(全長)一對一驗證
    4 結(jié)果與分析
        4.1 片段式酵母點對點驗證
        4.2 互作蛋白基因CDS序列克隆
        4.3 雙分子熒光互補載體構(gòu)建
        4.4 酵母雙雜交載體構(gòu)建
        4.5 雙分子熒光互補驗證
        4.6 酵母雙雜交驗證
            4.6.1 載體的自激活驗證
            4.6.2 酵母雙雜交(全長)一對一驗證
    5 討論
第六章 結(jié)論與展望
    1 研究結(jié)論
    2 研究展望
參考文獻
附錄
致謝



本文編號：3758829