水稻白葉枯病是一種世界性水稻細(xì)菌性病害,對(duì)水稻生產(chǎn)以及糧食的安全都造成了嚴(yán)重危害,因此對(duì)水稻抗病相關(guān)機(jī)制的研究尤為重要。本實(shí)驗(yàn)室前期已證明了OsmiR1858a超表達(dá)株系顯著提高了對(duì)白葉枯病的抗性,它的剪切靶基因?yàn)镺sHIN1(Harpin-induced 1 domain containing protein),超表達(dá)OsHIN1的水稻植株減弱了對(duì)白葉枯的抗性,而RNAi和敲除突變體則正好相反。這些結(jié)果證明OsHIN1負(fù)調(diào)控水稻對(duì)白葉枯病的抗性,但機(jī)制不詳。因此,對(duì)OsHIN1負(fù)調(diào)控水稻抗白葉枯病的機(jī)制進(jìn)行探索非常必要。OsHIN1為未知功能蛋白,為了明確它可能的作用網(wǎng)絡(luò),擬通過(guò)鑒定OsHIN1表達(dá)特點(diǎn)、亞細(xì)胞定位與鑒定它的互作蛋白,為闡明OsHIN1負(fù)調(diào)控水稻白葉枯病中的機(jī)制提供線索。主要研究結(jié)果如下:(1)克隆2kb OsHIN1啟動(dòng)子,構(gòu)建了pOsHIN1::GUS表達(dá)載體并遺傳轉(zhuǎn)化水稻,經(jīng)PCR檢測(cè)篩選獲得12株獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系(已經(jīng)獲得T1代種子)。對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻GUS染色結(jié)果表明,GUS在水稻幼嫩部位表達(dá)較多,成熟部位較少;在葉節(jié)點(diǎn)、根莖結(jié)合部、根毛等分生組織旺盛部位發(fā)現(xiàn)強(qiáng)的...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫(xiě)說(shuō)明
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 水稻白葉枯病概述
    2 水稻白葉枯病抗性基因研究進(jìn)展
        2.1 水稻抗白葉枯病主效基因研究進(jìn)展
            2.1.1 NBS-LRR類(lèi)
            2.1.2 LRR-RLK類(lèi)
            2.1.3 細(xì)胞壁相關(guān)激酶類(lèi)
            2.1.4 隱性基因類(lèi)
            2.1.5 Executor R基因類(lèi)
        2.2 水稻感白葉枯病主效基因研究進(jìn)展
            2.2.1 OsSWEET11和OsSWEET13
            2.2.2 OsSWEET14
            2.2.3 OsSWEET12和OsSWEET15
        2.3 水稻抗白葉枯病微效基因研究進(jìn)展
            2.3.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)
            2.3.2 MAPK基因家族
            2.3.3 免疫反應(yīng)相關(guān)類(lèi)
            2.3.4 miRNA
    3 水稻感白葉枯病機(jī)理研究
    4 水稻抗白葉枯病資源挖掘策略
    5 鑒定互作蛋白對(duì)抗病機(jī)理研究的作用
    6 研究意義及技術(shù)路線
        6.1 研究目的及意義
        6.2 技術(shù)路線
第二章 OsHIN1的器官表達(dá)
    1 前言
    2 材料與試劑
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2 試劑與菌株
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 pOsHIN1::GUS載體的構(gòu)建
            3.1.1 引物的設(shè)計(jì)
            3.1.2 目的片段的擴(kuò)增
            3.1.3 載體的酶切
            3.1.4 目的片段及載體回收
            3.1.5 連接與轉(zhuǎn)化
            3.1.6 載體的驗(yàn)證與保存
        3.2 農(nóng)桿菌EHA105的轉(zhuǎn)化
            3.2.1 農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞的制備
            3.2.2 表達(dá)載體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
            3.2.3 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的鑒定及菌液保存
        3.3 水稻遺傳轉(zhuǎn)化
            3.3.1 水稻愈傷組織的誘導(dǎo)
            3.3.2 愈傷組織的繼代
            3.3.3 農(nóng)桿菌培養(yǎng)
            3.3.4 愈傷組織的侵染和共培養(yǎng)
            3.3.5 脫菌和篩選
            3.3.6 分化
            3.3.7 生根及煉苗
        3.4 pOsHIN1::GUS轉(zhuǎn)基因苗的驗(yàn)證
            3.4.1 基因組DNA的提取
            3.4.2 PCR驗(yàn)證
        3.5 GUS染色
            3.5.1 水稻白葉枯菌P6的培養(yǎng)
            3.5.2 水稻白葉枯菌的接種
            3.5.3 GUS染色
    4 結(jié)果與分析
        4.1 pOsHIN1::GUS的載體構(gòu)建
        4.2 pOsHIN1::GUS遺傳轉(zhuǎn)化
        4.3 GUS染色
    5 討論
第三章 OsHIN1的亞細(xì)胞定位
    1 前言
    2 材料與試劑
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 高純度質(zhì)粒提取
        3.2 水稻原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化
    4 結(jié)果分析
    5 討論
第四章 OsHIN1互作蛋白的篩選
    1 前言
    2 材料與試劑
        2.1 材料
        2.2 試劑和菌株
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 35S::eGFP(ATG)和35S::OsHIN1:eGFP載體的構(gòu)建
            3.1.1 引物的設(shè)計(jì)
            3.1.2 目的片段的擴(kuò)增
            3.1.3 載體的酶切
            3.1.4 目的片段及載體回收
            3.1.5 連接與轉(zhuǎn)化
            3.1.6 載體的驗(yàn)證與保存
        3.2 農(nóng)桿菌EHα105的轉(zhuǎn)化
        3.3 水稻遺傳轉(zhuǎn)化
        3.4 35S::eGFP和35S::OsHIN1:eGFP轉(zhuǎn)基因苗的驗(yàn)證
        3.5 酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及篩選
            3.5.1 水稻幼苗的培養(yǎng)
            3.5.2 水稻白葉枯菌P6的培養(yǎng)
            3.5.3 水稻白葉枯菌P6的接種
            3.5.4 樣品的取送
    4 結(jié)果與分析
        4.1 載體構(gòu)建結(jié)果
        4.2 遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果
        4.3 酵母篩庫(kù)結(jié)果
    5 討論
第五章 OsHIN1互作蛋白的鑒定
    1 前言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 試劑與菌株
        2.2 材料與載體
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 片段式酵母點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證
        3.2 互作蛋白各基因CDS序列的克隆
            3.2.1 水稻總RNA的提取
            3.2.2 cDNA一鏈的合成
            3.2.3 基因序列的克隆
        3.3 雙分子熒光互補(bǔ)載體構(gòu)建
        3.4 酵母雙雜交載體構(gòu)建
        3.5 雙分子熒光互補(bǔ)驗(yàn)證
            3.5.1 BiFC載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101
            3.5.2 煙草注射
        3.6 酵母雙雜交(全長(zhǎng))驗(yàn)證
            3.6.1 載體的自激活驗(yàn)證
            3.6.2 酵母雙雜交(全長(zhǎng))一對(duì)一驗(yàn)證
    4 結(jié)果與分析
        4.1 片段式酵母點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證
        4.2 互作蛋白基因CDS序列克隆
        4.3 雙分子熒光互補(bǔ)載體構(gòu)建
        4.4 酵母雙雜交載體構(gòu)建
        4.5 雙分子熒光互補(bǔ)驗(yàn)證
        4.6 酵母雙雜交驗(yàn)證
            4.6.1 載體的自激活驗(yàn)證
            4.6.2 酵母雙雜交(全長(zhǎng))一對(duì)一驗(yàn)證
    5 討論
第六章 結(jié)論與展望
    1 研究結(jié)論
    2 研究展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝



本文編號(hào)：3758829