殺草丹（S-（4-氯芐基）N,N-二乙基硫代氨基甲酸酯）是一種高效,廣譜和高選擇性的硫代氨基甲酸酯類除草劑,能夠有效的防治禾本科雜草與部分闊葉雜草,因?qū)λ咎镏邪薏莺团Ｃ莸姆莱哂刑匦?在世界范圍內(nèi)廣泛用作稻田除稗劑。殺草丹對水生生物,兩棲動物和無脊椎動物高毒,土壤中殺草丹殘留對藻類和微生物的群落結(jié)構(gòu)也有較大影響。已有研究表明在空氣,土壤,河流與生物體中均能檢測到殺草丹的存在。微生物降解是環(huán)境中殺草丹降解的主要因素,然而目前關(guān)于殺草丹降解菌的報道還十分有限,而且對殺草丹的純培養(yǎng)微生物水平上的代謝途徑及相關(guān)的降解酶和基因的研究仍未報道。因此分離篩選殺草丹高效降解菌株,從菌體,基因和酶學水平上研究殺草丹的微生物降解機制對于闡明殺草丹在環(huán)境中的降解轉(zhuǎn)化等行為及對殺草丹所污染環(huán)境的微生物修復具有重要意義。本研究利用微生物富集馴化技術(shù)從活性污泥中分離到一株殺草丹高效降解菌株T1,并對其降解特性進行了研究。利用高效液相色譜（HPLC）和氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）檢測方法鑒定到兩個殺草丹降解中間代謝產(chǎn)物。在培養(yǎng)過程中篩選到一株失去殺草丹降解能力的T1突變菌株（T1m）。通過對野生株和突變株全基因組序列... 

【文章頁數(shù)】：165 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號與縮略語說明
前言
第一章 文獻綜述
    第一節(jié) 殺草丹概述
        1 殺草丹簡介
        2 殺草丹的使用方法與除草機制
        3 殺草丹殘留對環(huán)境的危害
    第二節(jié) 殺草丹降解的研究進展
        1 殺草丹在環(huán)境中的降解方式
            1.1 光化學降解
            1.2 殺草丹在動植物中的降解
            1.3 殺草丹在土壤中的降解
        2 殺草丹降解菌的研究進展
        3 殺草丹降解酶的研究進展
    第三節(jié) 黃素依賴型單加氧酶概述
        1 黃素依賴型單加氧酶的分類
        2 C類FMN依賴型單加氧酶家族
            2.1 C或S原子加氧氧化
            2.2 苯環(huán)羥基化反應與脫氫氧化
            2.3 C-N/C-S鍵斷鍵氧化
            2.4 C類黃素依賴型單加氧酶的催化機制
    第四節(jié) 本論文的研究目的和意義
第二章 殺草丹降解菌株的分離鑒定及降解途徑研究
    第一節(jié) 殺草丹降解菌株的分離和鑒定
        1 材料與方法
            1.1 試劑與培養(yǎng)基
            1.2 殺草丹含量的測定
            1.3 殺草丹降解菌的富集,篩選與純化
            1.4 菌株形態(tài)和生理生化特性的鑒定
            1.5 降解菌株16S rRNA基因序列分析
        2 結(jié)果與分析
            2.1 殺草丹降解菌株的篩選、分離與純化
            2.2 突變菌株T1m的篩選
            2.3 殺草丹降解菌株T1的初步鑒定
            2.4 菌株BUT-10的鑒定
    第二節(jié) 菌株T1對殺草丹降解特性的研究
        1 材料與方法
            1.1 實驗材料
            1.2 降解菌株T1菌懸液的制備
            1.3 溫度和pH對菌株T1降解殺草丹的影響
            1.4 接種量對菌株T1降解殺草丹的影響
            1.5 殺草丹初始濃度對菌株T1降解殺草丹的影響
            1.6 菌株T1對其他硫代氨基甲酸酯類除草劑的降解
        2 結(jié)果與分析
            2.1 溫度和pH對菌株T1降解殺草丹的影響
            2.2 菌體接種量對T1降解殺草丹的影響
            2.3 殺草丹的初始濃度對菌株T1降解殺草丹的影響
            2.4 菌株T1對其他硫代氨基甲酸酯類除草劑的降解
    第三節(jié) 菌株T1降解殺草丹的代謝產(chǎn)物鑒定及代謝途徑預測
        1 材料與方法
            1.1 實驗材料
            1.2 菌株T1菌懸液的制備
            1.3 菌株T1生長與殺草丹降解關(guān)系的探究
            1.4 菌株T1降解殺草丹中間代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定
            1.5 菌株T1及其突變株T1m的底物利用情況
        2 結(jié)果與分析
            2.1 菌株T1降解殺草丹與其生長的關(guān)系
            2.2 殺草丹降解中間代謝產(chǎn)物鑒定與代謝途徑預測
            2.3 菌株T1和突變株T1m的降解底物譜
    本章討論
    本章小結(jié)
第三章 殺草丹單加氧酶基因tmoAB的克隆與鑒定
    第一節(jié) 菌株T1和突變株T1m的全基因組測序與比對分析
        1 材料和方法
            1.1 培養(yǎng)基、試劑與供試菌株
            1.2 菌株基因組DNA的提取
            1.3 野生株T1及突變株T1m基因組測序
        2 結(jié)果與分析
            2.1 基因組DNA的提取和檢測
            2.2 野生株T1基因組完成圖的測序和組裝
            2.3 突變株T1m基因組框架圖的測序和組裝
            2.4 全基因組比對與突變株T1m丟失基因片段的查找,鑒定和分析
    第二節(jié) 殺草丹降解關(guān)鍵基因tmoAB的克隆與功能鑒定
        1 材料和方法
            1.1 培養(yǎng)基,試劑與供試菌株
            1.2 菌株、質(zhì)粒和引物
            1.4 殺草丹降解基因簇的功能驗證
            1.5 殺草丹誘導條件下菌株T1中基因tmoAB的轉(zhuǎn)錄水平分析
        2 結(jié)果與分析
            2.1 突變株T1m質(zhì)粒3中丟失基因片段的ORF分析
            2.2 重組菌株的殺草丹降解功能驗證
            2.3 殺草丹降解基因tmoAB在殺草丹誘導下的轉(zhuǎn)錄水平分析
    第三節(jié) 殺草丹單加氧酶TmoAB的表達,純化與酶學特性研究
        1 材料與方法
            1.1 菌株與試劑
            1.2 菌株、質(zhì)粒和引物
            1.3 殺草丹單加氧酶基因tmoA和tmoB表達載體的構(gòu)建
            1.4 TmoA和TmoB的誘導與表達
            1.5 目標蛋白TmoA和TmoB的純化
            1.6 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
            1.7 蛋白透析與保存
            1.8 TmoAB的殺草丹降解功能及降解產(chǎn)物鑒定
            1.9 殺草丹單加氧酶TmoAB酶學特性研究
            1.10 TmoA和TmoB的最佳摩爾濃度比例測定
            1.11 TmoAB和TmoB動力學參數(shù)的測定
            1.12 TmoAB的底物特異性
        2 結(jié)果與分析
            2.1 TmoA和TmoB的異源高效表達與純化
            2.2 殺草丹單加氧酶TmoAB的體外功能驗證
            2.3 殺草丹單加氧酶TmoAB的酶學特性研究
    本章討論
    本章小結(jié)
第四章 殺草丹下游代謝產(chǎn)物降解基因的克隆與功能驗證
    第一節(jié) 對氯苯甲醛脫氫酶基因tmoC的克隆與鑒定
        1 材料與方法
            1.1 培養(yǎng)基與試劑
            1.2 菌株、質(zhì)粒和引物
            1.3 對氯苯甲醛脫氫酶基因tmoC表達載體的構(gòu)建
            1.4 TmoC的誘導與表達
            1.5 目標蛋白TmoC的純化、SDS-PAGE、透析和保存
            1.6 TmoC的功能鑒定
            1.7 TmoC動力學參數(shù)的測定
        2 結(jié)果與分析
            2.1 對氯苯甲醛脫氫酶基因tmoC的克隆
            2.2 TmoC的異源表達與純化
            2.3 對氯苯甲醛脫氫酶TmoC的功能驗證
            2.4 對氯苯甲醛脫氫酶TmoC的動力學參數(shù)
    第二節(jié) 對氯苯甲酸降解基因簇的克隆與轉(zhuǎn)錄分析
        1 材料與方法
            1.1 培養(yǎng)基,試劑與供試菌株
            1.2 實時熒光定量PCR所用引物
            1.3 菌株T1中殺草丹下游產(chǎn)物降解基因的轉(zhuǎn)錄水平分析
        2 結(jié)果與分析
    本章討論
    本章小結(jié)
全文總結(jié)
研究創(chuàng)新點
研究展望
參考文獻
附錄
    附錄一 培養(yǎng)基與試劑配方
    附錄二 相關(guān)DNA序列
攻讀博士學位期間發(fā)表的論文與申請的專利
致謝



本文編號：3680182