燕麥矮縮病毒（Oat dwarf virus,ODV）是雙生病毒科玉米線條病毒屬的一個典型成員,其編碼的RepA蛋白是一個誘導(dǎo)植物過敏性反應(yīng)（HR）的效應(yīng)子。前期研究以O(shè)DV的RepA作為誘餌蛋白,通過酵母雙雜交系統(tǒng)從本氏煙的cDNA文庫中篩選到NbRFP是與RepA互作的候選互作因子之一。為了深入解析RepA誘導(dǎo)HR反應(yīng)的分子機(jī)理,本研究對NbRFP和RepA的互作進(jìn)一步進(jìn)行了體內(nèi)和體外驗證,并探討了這種互作調(diào)控RepA誘導(dǎo)HR的分子機(jī)制。從本氏煙中克隆了 NbRFP蛋白的全長cDNA序列,序列比對結(jié)果顯示其與普通煙上分離到的NtRFP蛋白的氨基酸序列同源性高達(dá)97%,而NtRFP已被證明是一個典型的RING型的E3泛素連接酶。利用qRT-PCR進(jìn)行NbRFP蛋白的組織特異性檢測,發(fā)現(xiàn)其于花期之前在根和葉中表達(dá)量較高,而在花期則在根和花中表達(dá)量較高。進(jìn)一步利用激光共聚焦顯微鏡觀察NbRFP蛋白的亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)其定位于煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。為了驗證NbRFP和RepA的互作,將NbRFP的全長cDNA構(gòu)建到pGADT7載體上,并將RepA構(gòu)建到pGBKT7載體上,通過酵母雙... 

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 HR是植物的一種免疫反應(yīng)
        1.1.1 HR的定義
        1.1.2 HR與植物免疫反應(yīng)的Z-模型
    1.2 病毒侵染誘導(dǎo)HR的研究
        1.2.1 植物應(yīng)對病毒的免疫反應(yīng)
        1.2.2 病毒侵染誘導(dǎo)HR的相關(guān)研究
        1.2.3 雙生病毒侵染誘導(dǎo)HR的相關(guān)研究
            1.2.3.1 雙生病毒的分類和基因組結(jié)構(gòu)
            1.2.3.2 雙生病毒編碼HR效應(yīng)子的相關(guān)研究
    1.3 E3泛素連接酶參與調(diào)控植物的免疫反應(yīng)
        1.3.1 E3泛素連接酶概況
        1.3.2 E3泛素連接酶參與植物-病原物互作
第二章 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株和載體
        2.1.3 試劑與儀器
        2.1.4 常用緩沖液的配制
    2.2 常規(guī)實驗方法
        2.2.1 培養(yǎng)基配制方法
            2.2.1.1 LB培養(yǎng)基
            2.2.1.2 YEP培養(yǎng)基
            2.2.1.3 麥康凱培養(yǎng)基
        2.2.2 常規(guī)分子克隆實驗技術(shù)
            2.2.2.1 普通PCR反應(yīng)
            2.2.2.2 高保真PCR反應(yīng)
            2.2.2.3 PCR產(chǎn)物回收與純化
            2.2.2.4 連接與酶切
            2.2.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備與轉(zhuǎn)化
            2.2.2.6 質(zhì)粒小量提取
    2.3 農(nóng)桿菌相關(guān)實驗技術(shù)
        2.3.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備
        2.3.2 電擊轉(zhuǎn)化
        2.3.3 農(nóng)桿菌瞬時浸潤
    2.4 植物葉片總RNA提取
    2.5 RT-PCR和qRT-PCR
        2.5.1 RT-PCR
        2.5.2 Real-time quantitative PCR (qRT-PCR)
    2.6 蛋白實驗相關(guān)技術(shù)
        2.6.1 葉片總蛋白提取
        2.6.2 SDS-PAGE
        2.6.3 Western blot技術(shù)
            2.6.3.1 電轉(zhuǎn)移
            2.6.3.2 Western印記分析
    2.7 酵母雙雜交
第三章 本氏煙NbRFP對ODV RepA誘導(dǎo)HR的影響
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 引物
        3.1.3 方法
            3.1.3.1 酵母轉(zhuǎn)化(LiAc法)
            3.1.3.2 蛋白的酵母互作驗證
            3.1.3.3 同源序列比對及功能域分析
            3.1.3.4 TRV病毒誘導(dǎo)的基因沉默
            3.1.3.5 qRT-PCR分析
            3.1.3.6 NbRFP基因的組織特異性表達(dá)分析
            3.1.3.7 轉(zhuǎn)基因過表達(dá)及陽性鑒定
            3.1.3.8 雙分子熒光互補(bǔ)實驗(BiFC)
            3.1.3.9 免疫沉淀反應(yīng)(Co-immunoprecipitation,Co-IP)
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 NbRFP基因的克隆與序列分析
        3.2.2 酵母雙雜驗證NbRFP蛋白與RepA的互作
        3.2.3 BiFC驗證NbRFP與RepA蛋白在植物體內(nèi)的互作
        3.2.4 Co-IP驗證NbRFP與RepA蛋白在植物體內(nèi)的互作
        3.2.5 NbRFP表達(dá)的組織特異性分析
        3.2.6 NbRFP在煙草中的亞細(xì)胞定位
        3.2.7 RepA蛋白顯著上調(diào)NbRFP mRNA的表達(dá)水平
        3.2.8 沉默NbRFP對RepA誘導(dǎo)HR的影響
        3.2.9 過表達(dá)NbRFP對RepA誘導(dǎo)HR的影響
        3.2.10 NbRFP與RepA蛋白互作結(jié)構(gòu)域的鑒定
        3.2.11 NbRFP的RING finger domain對RepA誘導(dǎo)HR的影響
    3.3 討論
第四章 過表達(dá)NbRFP后ODV RepA誘導(dǎo)HR的表達(dá)譜分析
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
            4.1.2.1 接種和取樣
            4.1.2.2 建立文庫和測序
            4.1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)信息分析流程
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 數(shù)據(jù)比對和質(zhì)控
        4.2.2 基因定量分析
        4.2.3 生物學(xué)重復(fù)的樣品表達(dá)譜測序數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析
        4.2.4 顯著差異基因分析
        4.2.5 差異基因的GO功能顯著性富集分析
        4.2.6 差異基因的Pathway顯著性富集分析
    4.3 討論
第五章 全文小結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ 常用生化及分子生物學(xué)試劑與儀器
附錄Ⅱ 常用緩沖液配方
附錄Ⅲ 本論文中所用術(shù)語縮寫與中英文對照


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]河北東部沿海地區(qū)野生大豆病毒病抗性與幾種酶活性的關(guān)系[J]. 史鳳玉,朱英波,龍茹,楊晴,李海潮,李桂蘭,喬亞科.  植物病理學(xué)報. 2008(04)



本文編號：3673897