燕麥矮縮病毒（Oat dwarf virus,ODV）是雙生病毒科玉米線條病毒屬的一個典型成員,其編碼的RepA蛋白是一個誘導植物過敏性反應（HR）的效應子。前期研究以ODV的RepA作為誘餌蛋白,通過酵母雙雜交系統(tǒng)從本氏煙的cDNA文庫中篩選到NbRFP是與RepA互作的候選互作因子之一。為了深入解析RepA誘導HR反應的分子機理,本研究對NbRFP和RepA的互作進一步進行了體內和體外驗證,并探討了這種互作調控RepA誘導HR的分子機制。從本氏煙中克隆了 NbRFP蛋白的全長cDNA序列,序列比對結果顯示其與普通煙上分離到的NtRFP蛋白的氨基酸序列同源性高達97%,而NtRFP已被證明是一個典型的RING型的E3泛素連接酶。利用qRT-PCR進行NbRFP蛋白的組織特異性檢測,發(fā)現(xiàn)其于花期之前在根和葉中表達量較高,而在花期則在根和花中表達量較高。進一步利用激光共聚焦顯微鏡觀察NbRFP蛋白的亞細胞定位,發(fā)現(xiàn)其定位于煙草表皮細胞的細胞核和細胞質中。為了驗證NbRFP和RepA的互作,將NbRFP的全長cDNA構建到pGADT7載體上,并將RepA構建到pGBKT7載體上,通過酵母雙... 

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 HR是植物的一種免疫反應
        1.1.1 HR的定義
        1.1.2 HR與植物免疫反應的Z-模型
    1.2 病毒侵染誘導HR的研究
        1.2.1 植物應對病毒的免疫反應
        1.2.2 病毒侵染誘導HR的相關研究
        1.2.3 雙生病毒侵染誘導HR的相關研究
            1.2.3.1 雙生病毒的分類和基因組結構
            1.2.3.2 雙生病毒編碼HR效應子的相關研究
    1.3 E3泛素連接酶參與調控植物的免疫反應
        1.3.1 E3泛素連接酶概況
        1.3.2 E3泛素連接酶參與植物-病原物互作
第二章 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株和載體
        2.1.3 試劑與儀器
        2.1.4 常用緩沖液的配制
    2.2 常規(guī)實驗方法
        2.2.1 培養(yǎng)基配制方法
            2.2.1.1 LB培養(yǎng)基
            2.2.1.2 YEP培養(yǎng)基
            2.2.1.3 麥康凱培養(yǎng)基
        2.2.2 常規(guī)分子克隆實驗技術
            2.2.2.1 普通PCR反應
            2.2.2.2 高保真PCR反應
            2.2.2.3 PCR產(chǎn)物回收與純化
            2.2.2.4 連接與酶切
            2.2.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細胞制備與轉化
            2.2.2.6 質粒小量提取
    2.3 農桿菌相關實驗技術
        2.3.1 農桿菌感受態(tài)細胞制備
        2.3.2 電擊轉化
        2.3.3 農桿菌瞬時浸潤
    2.4 植物葉片總RNA提取
    2.5 RT-PCR和qRT-PCR
        2.5.1 RT-PCR
        2.5.2 Real-time quantitative PCR (qRT-PCR)
    2.6 蛋白實驗相關技術
        2.6.1 葉片總蛋白提取
        2.6.2 SDS-PAGE
        2.6.3 Western blot技術
            2.6.3.1 電轉移
            2.6.3.2 Western印記分析
    2.7 酵母雙雜交
第三章 本氏煙NbRFP對ODV RepA誘導HR的影響
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 引物
        3.1.3 方法
            3.1.3.1 酵母轉化(LiAc法)
            3.1.3.2 蛋白的酵母互作驗證
            3.1.3.3 同源序列比對及功能域分析
            3.1.3.4 TRV病毒誘導的基因沉默
            3.1.3.5 qRT-PCR分析
            3.1.3.6 NbRFP基因的組織特異性表達分析
            3.1.3.7 轉基因過表達及陽性鑒定
            3.1.3.8 雙分子熒光互補實驗(BiFC)
            3.1.3.9 免疫沉淀反應(Co-immunoprecipitation,Co-IP)
    3.2 結果與分析
        3.2.1 NbRFP基因的克隆與序列分析
        3.2.2 酵母雙雜驗證NbRFP蛋白與RepA的互作
        3.2.3 BiFC驗證NbRFP與RepA蛋白在植物體內的互作
        3.2.4 Co-IP驗證NbRFP與RepA蛋白在植物體內的互作
        3.2.5 NbRFP表達的組織特異性分析
        3.2.6 NbRFP在煙草中的亞細胞定位
        3.2.7 RepA蛋白顯著上調NbRFP mRNA的表達水平
        3.2.8 沉默NbRFP對RepA誘導HR的影響
        3.2.9 過表達NbRFP對RepA誘導HR的影響
        3.2.10 NbRFP與RepA蛋白互作結構域的鑒定
        3.2.11 NbRFP的RING finger domain對RepA誘導HR的影響
    3.3 討論
第四章 過表達NbRFP后ODV RepA誘導HR的表達譜分析
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
            4.1.2.1 接種和取樣
            4.1.2.2 建立文庫和測序
            4.1.2.3 標準信息分析流程
    4.2 結果與分析
        4.2.1 數(shù)據(jù)比對和質控
        4.2.2 基因定量分析
        4.2.3 生物學重復的樣品表達譜測序數(shù)據(jù)的相關性分析
        4.2.4 顯著差異基因分析
        4.2.5 差異基因的GO功能顯著性富集分析
        4.2.6 差異基因的Pathway顯著性富集分析
    4.3 討論
第五章 全文小結
參考文獻
附錄Ⅰ 常用生化及分子生物學試劑與儀器
附錄Ⅱ 常用緩沖液配方
附錄Ⅲ 本論文中所用術語縮寫與中英文對照


【參考文獻】：
期刊論文
[1]河北東部沿海地區(qū)野生大豆病毒病抗性與幾種酶活性的關系[J]. 史鳳玉,朱英波,龍茹,楊晴,李海潮,李桂蘭,喬亞科.  植物病理學報. 2008(04)



本文編號：3673897