水貂阿留申�。ˋleutian Mink Disease,AMD）作為毛皮動(dòng)物三大疫病之一,對(duì)水貂養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因其特殊的發(fā)病機(jī)理,尚無有效的藥物或疫苗來防治此病,只能通過對(duì)貂群檢疫凈化淘汰來控制病情。目前主要采用的針對(duì)抗體檢測(cè)的對(duì)流免疫電泳法（CIEP）在對(duì)阿留申疾病的發(fā)病前期檢測(cè)存在敏感性差問題,并且對(duì)部分康復(fù)水貂檢測(cè)仍顯示陽性,不利于進(jìn)行阿留申病的抗病育種篩選;以及近年來隨著阿留申病毒的不斷傳播和變異,普通病原檢測(cè)方法常出現(xiàn)漏檢的狀況。雙重PCR方法在檢測(cè)多種病原微生物感染時(shí)具有省時(shí)省力、簡(jiǎn)單快速、敏感高、特異強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),已在多種病毒的鑒定與檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用。目前,在我國水貂群中AMDV普遍存在,應(yīng)用雙重PCR方法檢測(cè)AMDV的方法還沒有建立。本研究通過參考GenBank上已發(fā)表的AMDV序列進(jìn)行比對(duì),選擇在NS1基因的保守區(qū)和VP2基因的保守區(qū)分別設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)NS1基因片段的特異性引物NS1-F/NS1-R和一對(duì)針對(duì)VP2基因片段的特異性引物VP2-F/VP2-R,建立雙重PCR檢測(cè)方法。通過單一PCR均能擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶:NS1目的片段為568bp,VP2目... 

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
符號(hào)說明
中文摘要
Abstract
1.前言
    1.1 病原學(xué)
        1.1.1 病原學(xué)分類
        1.1.2 病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)和理化特性
        1.1.3 ADV毒株及培養(yǎng)特性
        1.1.4 AMDV的分子生物特征
            1.1.4.1 AMDV基因組
            1.1.4.2 AMDV基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄
            1.1.4.3 AMDV的蛋白及其功能
    1.2 AMDV的流行病學(xué)
        1.2.1 AMDV的宿主
        1.2.2 AMDV的傳播方式
        1.2.3 AMDV的發(fā)病機(jī)制
        1.2.4 AMDV的臨床癥狀
        1.2.5 AMDV病理變化
    1.3 AMDV的診斷
        1.3.1 病原學(xué)診斷
        1.3.2 血清學(xué)診斷
            1.3.2.1 碘凝集實(shí)驗(yàn)(IAT)
            1.3.2.2 對(duì)流免疫電泳(CIEP)
            1.3.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)
            1.3.2.4 間接免疫熒光試驗(yàn)(IIF)
            1.3.2.5 補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)(CF)
            1.3.2.6 免疫復(fù)合物檢測(cè)法(CIC)
            1.3.2.7 淋巴細(xì)胞酯酶標(biāo)記
            1.3.2.8 酶標(biāo)斑點(diǎn)紙條法
        1.3.3 分子生物學(xué)診斷
            1.3.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
            1.3.3.2 核酸雜交技術(shù)
            1.3.3.3 基因檢測(cè)芯片
            1.3.3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)
    1.4 水貂示范場(chǎng)生物安全體系的建立
        1.4.1 水貂示范場(chǎng)外部環(huán)境生物安全體系建立
        1.4.2 水貂示范場(chǎng)內(nèi)部環(huán)境生物安全體系建立
            1.4.2.1 動(dòng)物疫病的防控
            1.4.2.2 加強(qiáng)日常管理
            1.4.2.3 加強(qiáng)引種監(jiān)測(cè)
            1.4.2.4 完善防疫制度
            1.4.2.5 疫苗預(yù)防和藥物治療
            1.4.2.6 定期疾病檢測(cè)
    1.5 本研究的目的及意義
2.材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 菌種與質(zhì)粒
    2.2 方法
        2.2.1 試劑的配制
        2.2.2 引物設(shè)計(jì)
        2.2.3 采用 DNA 試劑盒對(duì)樣品組織進(jìn)行 DNA 的提取
        2.2.4 NS1和VP2片段的PCR擴(kuò)增
        2.2.5 PCR產(chǎn)物回收純化
        2.2.6 重組載體構(gòu)建
        2.2.7 DH5α感受態(tài)細(xì)胞制備
        2.2.8 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.2.9 重組質(zhì)粒的提取
        2.2.10 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
    2.3 單重PCR方法建立
        2.3.1 單重PCR目的條帶的優(yōu)化
        2.3.2 單重PCR特異性試驗(yàn)
        2.3.3 單重PCR敏感性試驗(yàn)
        2.3.4 單重PCR重復(fù)性試驗(yàn)
    2.4 雙重PCR方法建立
        2.4.1 雙重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
        2.4.2 雙重PCR特異性試驗(yàn)
        2.4.3 雙重PCR敏感性試驗(yàn)
        2.4.4 雙重PCR重復(fù)性試驗(yàn)
    2.5 山東地區(qū)某示范水貂場(chǎng)AMDV的檢疫凈化
3.結(jié)果
    3.1 NS1和VP2基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果
    3.2 重組載體的酶切鑒定結(jié)果
    3.3 測(cè)序結(jié)果與樣品毒株比較
    3.4 單重PCR測(cè)試結(jié)果
        3.4.1 單重PCR目的片段優(yōu)化結(jié)果
        3.4.2 單重PCR特異性試驗(yàn)的結(jié)果
        3.4.3 單重PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果
        3.4.4 單重PCR重復(fù)性試驗(yàn)
    3.5 雙重PCR檢測(cè)結(jié)果
        3.5.1 雙重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
        3.5.2 雙重PCR特異性試驗(yàn)
        3.5.3 雙重PCR的敏感性試驗(yàn)
        3.5.4 雙重PCR重復(fù)性試驗(yàn)
    3.6 山東地區(qū)某水貂示范場(chǎng)AMDV的檢測(cè)結(jié)果
4.討論
    4.1 雙重PCR方法的建立
    4.2 阿留申疾病的檢疫
5.結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]水貂阿留申病的診斷與防治[J]. 李存美.  山東畜牧獸醫(yī). 2017(01)
[2]對(duì)流免疫電泳在水貂阿留申病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 莊金秋,梅建國,王玉茂,姚春陽,趙元楷.  經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào). 2015(03)
[3]水貂阿留申病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法的建立[J]. 田國寧,張金玲,李凱,田國華,丁葵英.  中國動(dòng)物檢疫. 2015(06)
[4]水貂血液阿留申病病毒及其抗體的檢測(cè)與分析[J]. 邵西群,章秀婷,岳志剛,榮敏,閆喜軍,楊福合.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2014(12)
[5]中國毛皮產(chǎn)業(yè)發(fā)展歷程與現(xiàn)狀分析[J]. 鄭策,張旭,全穎,凌立瑩,劉彥.  特產(chǎn)研究. 2013(03)
[6]水貂養(yǎng)殖的研究進(jìn)展[J]. 羅佳捷,張彬,王潔,陳登科.  飼料博覽. 2013(03)
[7]水貂阿留申病毒結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白的研究進(jìn)展[J]. 甘露,劉立兵,時(shí)坤,李健明,杜銳.  經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào). 2012(03)
[8]水貂的繁殖生理特性[J]. 王華.  特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物. 2012(04)
[9]水貂阿留申病的研究進(jìn)展[J]. 王克祥,劉永逵,孫宏磊.  中國畜牧獸醫(yī). 2010(12)
[10]水貂阿留申病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 劉曉,刁燕,杜銳.  經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào). 2010(01)

碩士論文
[1]水貂阿留申病病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及間接ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[D]. 韓鎧懌.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]養(yǎng)殖水貂阿留申病感染情況及分子流行病學(xué)的研究[D]. 馬建.東北林業(yè)大學(xué) 2005



本文編號(hào)：3664837