磷酸二酯酶（PDEs）是細(xì)胞廣泛存在的一類水解酶,通過水解諸如環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）等物質(zhì)的磷酸二酯鍵,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的多種信號傳導(dǎo)和生理活動。目前已從生物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)具有不同結(jié)構(gòu)的11種PDEs。不同種類的PDEs在細(xì)胞內(nèi)分布、表達(dá)、調(diào)節(jié)方式以及對抑制劑的耐受性存在差異,發(fā)揮不同的生理功能。YmdB最初發(fā)現(xiàn)是存在于枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）中的一種PDE,參與調(diào)節(jié)細(xì)菌的生物膜形成、運動性、胞外多糖產(chǎn)生、雙穩(wěn)定性等多種生理性狀。蠟樣芽孢桿菌0-9是前期研究中獲得的一株小麥土傳病害生防細(xì)菌,可以定殖在小麥根部,并且具有易于培養(yǎng)鑒定、形成生物膜和運動能力等。通過分析0-9菌株基因組中的編碼基因的氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)存在一個基因其氨基酸序列與及subtB.is中YmdB具有34%的同源性,同時發(fā)現(xiàn)二者具有相似的結(jié)構(gòu)。該基因及其編碼產(chǎn)物在蠟樣芽孢桿菌中的功能尚沒有報道。在此,我們通過基因敲除和回補(bǔ)研究該基因（暫命名為ymdB）的功能,分析該基因?qū)τ谏锬ば纬珊蛯τ诿掴徬x致病性的影響。為了分析ymdB基因的功能,利用同源重組的方法構(gòu)建ymdB基因缺失菌株即Δy... 

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 前言
    1.1 磷酸二酯酶(PDEs)
        1.1.1 磷酸二酯酶的分類及功能
        1.1.2 細(xì)菌中的磷酸二酯酶(PDEs)
        1.1.3 PDEs水解底物cAMP、cGMP在細(xì)菌中的調(diào)節(jié)
        1.1.4 磷酸二酯酶編碼基因ymdB
    1.2 微生物生物膜
        1.2.1 生物膜的簡介
        1.2.2 生物膜中的組成成分及形成過程
        1.2.3 生物膜的形成機(jī)制
    1.3 立題依據(jù)
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 引物設(shè)計
        2.1.3 培養(yǎng)基
        2.1.4 所用試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 感受態(tài)制備方法
        2.2.2 基因缺失菌株的構(gòu)建
        2.2.3 基因互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
        2.2.4 YmdB蛋白表達(dá)菌株的構(gòu)建
        2.2.5 YmdB蛋白誘導(dǎo)純化及酶活測定方法
        2.2.6 生物學(xué)性狀的測定
        2.2.7 生物膜形成能力的測定及棉鈴蟲毒性作用
        2.2.8 蛋白免疫印記(Western blot)方法
        2.2.9 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR方法
3 結(jié)果與分析
    3.1 基因缺失菌株及互補(bǔ)菌株構(gòu)建
        3.1.1 ymdB基因缺失菌株構(gòu)建
        3.1.2 ymdB/sinR和ymdB/sinI基因缺失菌株構(gòu)建
        3.1.3 基因互補(bǔ)菌株構(gòu)建
    3.2 ymdB基因缺失對B.cereus 0-9生理功能的影響
        3.2.1 ymdB基因?qū).cereus 0-9菌落形態(tài)的影響
        3.2.2 ymdB基因?qū).cereus 0-9菌落群體生長及鹽敏感性的影響
        3.2.3 基因缺失對B.cereus 0-9菌株運動能力的影響
        3.2.4 ymdB基因缺失對B.cereus 0-9胞外蛋白酶形成能力的影響
        3.2.5 ymdB基因缺失對B.cereus 0-9芽孢形成能力的影響
        3.2.6 ymdB基因缺失對B.cereus 0-9菌株的溶血能力的影響
    3.3 ymdB基因編碼產(chǎn)物是一種磷酸二酯酶
        3.3.1 ymdB基因蛋白表達(dá)菌株的構(gòu)建
        3.3.2 YmdB蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        3.3.3 YmdB蛋白酶活的測定
    3.4 YmdB對B.cereus 0-9的生物膜形成的影響
        3.4.1 YmdB參與B.cereus 0-9的生物膜形成
        3.4.2 測定YmdB是否通過SinR/SinI調(diào)控對生物膜形成的影響
        3.4.3 受SinR調(diào)控的基因在B.cereus 0-9、AymdB的表達(dá)量
        3.4.4 與生物膜形成有關(guān)的生物學(xué)性狀的測定
    3.5 測定YmdB蛋白和ymdB基因在B.cereus 0-9中的表達(dá)量
    3.6 YmdB對參與B.cereus 0-9對棉鈴蟲毒性的作用
4 結(jié)論
5 討論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3663897