包囊和吞噬作用是由血細胞介導的兩種免疫反應,是昆蟲先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。包囊作用是由多個血細胞參與的、針對較大的病原物（如寄生蜂的卵、病原線蟲等）的清除,而吞噬作用是單個血細胞針對較小病原物（如細菌、病毒等）的清除。蛻皮激素的活化形式20-羥基蛻皮酮（20-hydroxyecdysone,20E）作為調(diào)控昆蟲蛻皮、變態(tài)、生殖、發(fā)育等過程的重要激素,也參與調(diào)節(jié)多種免疫應答,如細胞免疫（包囊和吞噬）。然而,目前我們對昆蟲細胞免疫及其內(nèi)分泌調(diào)控分子機制尚不清楚。本研究以棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）為模型,首先統(tǒng)計了中華卵索線蟲（Ovomermissinemsis 寄生后棉鈴蟲的死亡率,并分析了棉鈴蟲應答O.sinesis.寄生后的免疫反應。結果發(fā)現(xiàn)O.sinensis寄生后導致了棉鈴蟲存活率急劇下降,且寄生早期棉鈴蟲的血細胞吞噬能力和血漿抗菌活性顯著升高。為了進一步獲得識別O.sinensis并觸發(fā)先天免疫反應的關鍵蛋白,我們將O.sinensis與棉鈴蟲變態(tài)期血漿孵育,經(jīng)洗滌、洗脫后質(zhì)譜鑒定,獲得一個模式識別蛋白C-typelectin1b（HaCTL1b）,該... 

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學位級別】：碩士

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摘要
Abstract
1 前言
    1.1 昆蟲免疫系統(tǒng)
        1.1.1 體液免疫
        1.1.2 細胞免疫
    1.2 包囊反應
    1.3 吞噬反應
    1.4 20-羥基蛻皮酮
    1.5 棉鈴蟲
    1.6 害蟲防治
    1.7 研究背景及意義
2 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 棉鈴蟲
        2.1.2 白兔
        2.1.3 線蟲
        2.1.4 菌株
        2.1.5 試劑、藥品
        2.1.6 儀器與設備
        2.1.7 常用試劑及培養(yǎng)基的配置
        2.1.8 實驗用到的引物序列
    2.2 實驗方法
        2.2.1 中華卵索線蟲寄生棉鈴蟲實驗
        2.2.2 寄生中華卵索線蟲的棉鈴蟲血細胞吞噬細菌實驗
        2.2.3 寄生中華卵索線蟲的棉鈴蟲血漿抗菌活性測定實驗
        2.2.4 HaCTL1b基因全長、信號肽編碼蛋白序列分析
        2.2.5 棉鈴蟲各組織RNA的提取
        2.2.6 合成cDNA第一鏈(TRANS Easy Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)
        2.2.7 cDNA的質(zhì)量檢測
        2.2.8 HaCTL1b基因的原核重組表達與純化
        2.2.9 HaCTL1b抗體的制備
        2.2.10 Western blot抗體檢測實驗
        2.2.11 熒光定量分析HaCTL1基因的表達模式
        2.2.12 Western blot檢測HaCTL1在棉鈴蟲不同發(fā)育階段的蛋白水平表達模式
        2.2.13 rHaCTL1b的凝集和結合實驗
        2.2.14 E.coli 和 aureus刺激HaCTL1的表達實驗
        2.2.15 HaCTL1的RNA干擾實驗
        2.2.16 檢測HaCTL1敲降后對包囊率的影響
        2.2.17 檢測孵育rHaCTL1b對包囊率的影響
        2.2.18 孵育rHaCTL1b對血細胞吞噬率的影響
        2.2.19 檢測HaCTL1敲降后對血細胞吞噬率的影響
3 結果與分析
    3.1 中華卵索線蟲寄生對棉鈴蟲存活率的影響
    3.2 中華卵索線蟲寄生對棉鈴蟲免疫應答的影響
    3.3 棉鈴蟲HaCTL1b基因的鑒定與生物信息學分析
    3.4 rHaCTL1b的表達與純化
        3.4.1 重組質(zhì)粒pET-32a-HaCTL1b的構建
        3.4.2 陽性篩選結果
        3.4.3 重組蛋白rHaCTL1b的表達與純化
    3.5 Anti-HaCTL1b抗血清識別rHaCTL1b和內(nèi)源HaCTL1
    3.6 HaCTL1的組織特異性表達模式分析
    3.7 HaCTL1在不同發(fā)育階段的表達分析
    3.8 20E誘導HaCTL1的表達
    3.9 Beads刺激誘導HaCTL1表達
    3.10 HaCTL1促進血細胞包囊
    3.11 rHaCTL1b促進細菌凝集
    3.12 rHaCTL1b與細菌結合活性分析
    3.13 細菌刺激誘導HaCTL1基因和蛋白的表達
    3.14 孵育rHaCTL1b促進血細胞吞噬率
    3.15 敲降HaCTL1降低血細胞吞噬率
4 討論
5 小結與展望
參考文獻
攻讀碩士期間論文發(fā)表情況
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]誘殺技術在害蟲綜合治理（IPM）中的應用[J]. 閆凱莉,唐良德,吳建輝,畢志兼.  中國植保導刊. 2016(06)
[2]昆蟲天然免疫反應研究前沿[J]. 初源,周帆,張明明,安春菊.  應用昆蟲學報. 2013(02)
[3]昆蟲免疫進化的研究進展[J]. 周瓊.  福建農(nóng)業(yè)學報. 2007(04)
[4]中華卵索線蟲感染棉鈴蟲后的血淋巴病理學研究[J]. 陳伍國,駱啟桂,王丹,高原.  華中師范大學學報(自然科學版). 2002(03)
[5]武昌羅索線蟲（Romanomermis wuchangensis）生活史的研究[J]. 駱啟桂.  華中師范大學學報(自然科學版). 1987(03)

碩士論文
[1]HaCTL3和HaGBPB介導20E信號調(diào)控棉鈴蟲細胞免疫的分子機理[D]. 卓曉蓉.華中師范大學 2018
[2]武昌羅索線蟲性別分化差異基因篩選及功能研究[D]. 陶斯瑩.華中師范大學 2018
[3]棉鈴蟲兩種C-型凝集素HaCTL3和HaCTL7的功能研究[D]. 張旗.華中師范大學 2013



本文編號：3653331