水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus,RGDV）主要由介體電光葉蟬（Recilia dorsalis）進(jìn)行傳播。近年來(lái)關(guān)于電光葉蟬與RGDV互作方面的研究相繼增多,但在探究電光葉蟬先天免疫機(jī)制方面還不多。病毒通過(guò)侵染宿主細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)其存活并增殖,自噬作為一種有效的防御途徑,可以保護(hù)細(xì)胞免于受病原微生物的侵害。明確RGDV侵染介體電光葉蟬對(duì)細(xì)胞自噬反應(yīng)的影響,可為闡明電光葉蟬傳播RGDV的特異性機(jī)理提供依據(jù)。本研究主要探討RGDV是否會(huì)誘導(dǎo)介體昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞及蟲體內(nèi)的自噬反應(yīng),進(jìn)而影響自身的增殖和擴(kuò)散,以揭示RGDV與介體昆蟲互作的機(jī)制。首先分析電光葉蟬轉(zhuǎn)錄組中自噬Marker蛋白Atg8的基因和氨基酸序列,設(shè)計(jì)特異引物克隆Atg8基因全長(zhǎng)片段。隨后連接至pDEST17原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化Rosetta菌誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE后收集目的蛋白條帶,免疫小白鼠,制備抗Atg8多克隆抗體,并交聯(lián)熒光素。接下來(lái)利用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)在RGDV侵染的電光葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞中標(biāo)記自噬蛋白Atg8和RGDV外殼蛋白P8,結(jié)果表明,RGDV侵染電光培養(yǎng)細(xì)胞可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬現(xiàn)象的發(fā)生,并且自噬隨... 

【文章來(lái)源】：福建農(nóng)林大學(xué)福建省

【文章頁(yè)數(shù)】：65 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 水稻瘤矮病毒
        1.1.1 水稻瘤矮病的發(fā)生、分布和癥狀
        1.1.2 水稻瘤矮病的寄主植物、病原及傳播介體
        1.1.3 水稻瘤矮病毒的基因組結(jié)構(gòu)及功能
    1.2 自噬
        1.2.1 自噬的分類
        1.2.2 自噬的發(fā)生過(guò)程
        1.2.3 自噬相關(guān)基因
        1.2.4 自噬的分子調(diào)節(jié)機(jī)制
        1.2.5 細(xì)胞自噬與病毒
    1.3 昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞概況及應(yīng)用
    1.4 免疫熒光技術(shù)
    1.5 本研究的目的及意義
2 實(shí)驗(yàn)材料
    2.1 供試材料
        2.1.1 電光葉蟬與水稻瘤矮病株
        2.1.2 感受態(tài)、載體和培養(yǎng)細(xì)胞
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備
3 實(shí)驗(yàn)方法
    3.1 自噬相關(guān)基因Atg8的多克隆抗體的制備
        3.1.1 引物設(shè)計(jì)
        3.1.2 電光葉蟬總RNA的提取
        3.1.3 自噬相關(guān)基因Atg8的擴(kuò)增
        3.1.4 入門載體pDONR221-Atg8的構(gòu)建
        3.1.5 原核表達(dá)載體pDEST17-Atg8的構(gòu)建
        3.1.6 原核表達(dá)載體pDEST17-Atg8轉(zhuǎn)入Rosetta (DE3)表達(dá)菌株
        3.1.7 自噬相關(guān)基因Atg8的原核誘導(dǎo)表達(dá)
        3.1.8 抗血清的制備
        3.1.9 Western blot檢測(cè)抗血清的特異性
        3.1.10 Atg8抗血清的純化
        3.1.11 Atg8抗體交聯(lián)熒光素
    3.2 RGDV激活電光葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞中的自噬現(xiàn)象
        3.2.1 RGDV病毒液的提取
        3.2.2 電光葉蟬單層培養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備
        3.2.3 RGDV病毒粗提液侵染電光葉蟬單層培養(yǎng)細(xì)胞
        3.2.4 免疫熒光標(biāo)記RGDV侵染的電光葉蟬細(xì)胞
        3.2.5 藥劑處理RGDV侵染的電光葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞
        3.2.6 dsRNAs的體外合成
        3.2.7 dsRNAs處理RGDV侵染的電光葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞
        3.2.8 RT-qPCR檢測(cè)藥劑或dsRNAs處理后細(xì)胞中基因表達(dá)
    3.3 RGDV激活電光葉蟬蟲體中的自噬現(xiàn)象
        3.3.1 免疫熒光觀察自噬和RGDV在電光葉蟬的組織定位
        3.3.2 免疫觀察dsRN As注射RGDV侵染電光葉蟬蟲體中腸內(nèi)RGDV的積累
        3.3.3 dsRNAs注射RGDV侵染電光葉蟬蟲體的RGDV的傳播效率
4 結(jié)果與分析
    4.1 自噬相關(guān)基因Atg8的多克隆抗體的制備
        4.1.1 自噬相關(guān)基因Atg8的擴(kuò)增
        4.1.2 入門載體pDONR221-Atg8的構(gòu)建
        4.1.3 原核表達(dá)載體pDEST17-Atg8的構(gòu)建
        4.1.4 原核表達(dá)載體pDEST17-Atg8轉(zhuǎn)入Rosetta (DE3)菌株
        4.1.5 自噬相關(guān)基因Atg8的原核表達(dá)
        4.1.6 Western blot檢測(cè)Atg8抗血清的特異性
    4.2 RGDV侵染激活電光葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞的自噬現(xiàn)象
        4.2.1 電光葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)
        4.2.2 RGDV侵染電光葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞自噬
        4.2.3 自噬促進(jìn)RGDV在電光葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞中增殖擴(kuò)散
    4.3 RGDV激活電光葉蟬蟲體中的自噬現(xiàn)象
        4.3.1 電光葉蟬不同組織器官的形態(tài)觀察
        4.3.2 RGDV侵染電光葉蟬蟲體誘導(dǎo)自噬
        4.3.3 自噬促進(jìn)RGDV在電光葉蟬蟲體中增殖擴(kuò)散
5 討論
6 小結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3569506