水稻是我國最重要的糧食作物,而稻瘟病是目前對水稻生產(chǎn)威脅最大的真菌病害。稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)（Chitin）作為一類保守的病原菌相關(guān)分子模式（Pathogen associated molecular pattern,PAMP）,可以被植物細(xì)胞膜上的模式識別受體（PAMP recognition receptor,PRR）Os CERK1間接識別,通過磷酸化的方式激活下游一系列生化生理反應(yīng),從而增強植物對病原菌的抗病性。絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）是一組能夠在PAMP識別后被激活的蛋白激酶,其基本組成是一種保守的三級激酶模式,包括MAPK激酶激酶（MAP kinase kinase kinase,MKKK）、MAPK激酶（MAP kinase kinase,MKK）和MAPK,這三種激酶通過依次磷酸化將上游信號傳遞至下游應(yīng)答分子,是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一。然而,植物如何將細(xì)胞膜產(chǎn)生的PAMP識別信號傳遞到下游MAPK,其機制仍然存在空白。細(xì)胞質(zhì)類受體激酶（Rec... 

【文章來源】：華東師范大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 PTI模式分子的識別
        1.1.1 細(xì)菌PAMP的識別
        1.1.2 真菌PAMP的識別
        1.1.3 卵菌PAMP的識別
        1.1.4 寄主細(xì)胞狀態(tài)變化(損傷相關(guān)的分子模式,DAMP)的識別
        1.1.5 特征信號分子的跨界識別
    1.2 經(jīng)典PRR模式識別系統(tǒng)——FLS2和EFR
    1.3 PRR參與調(diào)控共生互作
    1.4 PRR調(diào)控植物對環(huán)境因子變化的響應(yīng)
    1.5 PTI激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件以及細(xì)胞、生理反應(yīng)
        1.5.1 胞內(nèi)鈣離子濃度上升
        1.5.2 胞外堿化和細(xì)胞膜去極化反應(yīng)
        1.5.3 活性氧迸發(fā)
        1.5.4 細(xì)胞質(zhì)類受體激酶激活
        1.5.5 MAPK激活
        1.5.6 小G蛋白激活
    1.6 本課題的研究目的和意義
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌種
        2.1.3 載體
        2.1.4 主要試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 酵母雙雜交實驗
        2.2.2 植物RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和定量PCR
        2.2.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化
        2.2.4 Pulldown實驗
        2.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Westernblot)
        2.2.6 蛋白磷酸化檢測
        2.2.7 植物組織總蛋白提取
        2.2.8 Co-IP實驗
        2.2.9 MAPK活性檢測
        2.2.10 基因誘導(dǎo)表達(dá)處理
        2.2.11 稻瘟病侵染實驗
        2.2.12 本氏煙農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和病毒介導(dǎo)的基因沉默
第三章 結(jié)果
    3.1 篩選與OsRLCK185互作的水稻MEKK1家族成員
    3.2 OsRLCK185與OsMAPKKKε的互作驗證
        3.2.1 利用酵母雙雜交實驗驗證OsRLCK185與OsMAPKKKε的互作
        3.2.2 用體外Pulldown實驗驗證OsRLCK185與OsMAPKKKε的互作
        3.2.3 用體內(nèi)Co-IP實驗驗證OsRLCK185與OsMAPKKKε的互作
    3.3 OsMAPKKKε的C端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與OsRLCK185互作
    3.4 OsRLCK185磷酸化OsMAPKKKε
        3.4.1 OsRLCK185體外磷酸化OsMAPKKKε全長蛋白
        3.4.2 OsRLCK185體外磷酸化OsMAPKKKε的C端結(jié)構(gòu)域(aa769-1357)
        3.4.3 OsRLCK185體外磷酸化OsMAPKKKε的絲氨酸和蘇氨酸
    3.5 OsMAPKKKε能夠與OsMKK4、OsMKK5互作
        3.5.1 用酵母雙雜交技術(shù)驗證OsMAPKKKε與OsMKK4、OsMKK5互作
        3.5.2 用Co-IP技術(shù)驗證OsMAPKKKε與OsMKK4、OsMKK5互作
    3.6 OsMAPKKKε能夠磷酸化OsMKK
        3.6.1 體外磷酸化實驗證明OsMAPKKKε能夠磷酸化OsMKK
        3.6.2 用體內(nèi)磷酸化實驗證明OsMAPKKKε能夠磷酸化OsMKK
    3.7 OsCERK1促進(jìn)OsRLCK185與OsMAPKKKε的互作
    3.8 OsCERK1體外促進(jìn)OsRLCK185對OsMAPKKKε的磷酸化
    3.9 煙草細(xì)胞中模擬磷酸化形式的OsRLCK185-3D與OsMAPKKKε共表達(dá)可以激活MAPK磷酸化
    3.10 OsMAPKKKε沉默植株的MAPK響應(yīng)幾丁質(zhì)能力減弱
        3.10.1 OsMAPKKKε沉默水稻的MAPK響應(yīng)幾丁質(zhì)能力減弱
        3.10.2 NbMAPKKKε沉默本氏煙的MAPK響應(yīng)幾丁質(zhì)能力減弱
    3.11 OsMAPKKKε沉默植株對稻瘟抗病能力減弱
    3.12 全長OsMAPKKKε能夠在幾丁質(zhì)處理下激活MAPK級聯(lián)反應(yīng)
    3.13 OsMAPKKKε激酶結(jié)構(gòu)域組成型激活MAPK級聯(lián)反應(yīng)
        3.13.1 在本氏煙系統(tǒng)里OsMAPKKKε激酶結(jié)構(gòu)域能夠組成型激活MAPK級聯(lián)反應(yīng)
        3.13.2 在水稻體內(nèi)OsMAPKKKε激酶結(jié)構(gòu)域能夠組成型激活MAPK級聯(lián)反應(yīng)
    3.14 OsMAPKKKε激酶結(jié)構(gòu)域在本氏煙葉片中激活細(xì)胞壞死并且C端結(jié)構(gòu)域能夠調(diào)控該表型
    3.15 OsMAPKKKε激酶結(jié)構(gòu)域組成型激活防衛(wèi)相關(guān)基因表達(dá)
    3.16 OsMAPKKKε激酶結(jié)構(gòu)域組成性激活水稻對稻瘟抗病性
    3.17 OsMAPKKKε在根莖葉中均有表達(dá),其亞細(xì)胞定位有可能在細(xì)胞膜
    3.18 OsRACK1A作為支架蛋白與MAPK級聯(lián)通路互作
    3.19 OsRLCK185與OsRac1在酵母雙雜交系統(tǒng)中互作
    3.20 在酵母雙雜交系統(tǒng)中OsRLCK185與激活形式的OsRac1互作
    3.21 OsRLCK185能夠在體外磷酸化OsRac
    3.22 在酵母雙雜交系統(tǒng)中OsMAPKKKε與失活形式的OsRac1互作
    3.23 在酵母三雜交系統(tǒng)中激活形式的OsRac1能夠抑制OsRLCK185與OsMAPKKKε的互作
第四章 討論
    4.1 OsRLCK185直接將OsCERK1識別的幾丁質(zhì)信號傳遞至OsMAPKKKε-OsMKK4/5-OsMPK3/6組成的MAPK級聯(lián)通路模塊
    4.2 RLCK 和 MAPKKK 很可能具有冗余性
    4.3 Os MAPKKKε 如何在幾丁質(zhì)識別抗病信號中發(fā)揮功能
    4.4 小G蛋白OsRac1如何參與OsRLCK185-MAPK級聯(lián)通路
    4.5 RLCK 家族蛋白可能廣譜介導(dǎo)植物 RLK 對配體信號識別與MAPK級聯(lián)通路之間的聯(lián)系
第五章 全文的總結(jié)、創(chuàng)新點與展望
    5.1 全文總結(jié)
    5.2 創(chuàng)新點
    5.3 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
    1 經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的OsMAPKKKε序列
    2 引物列表
作者簡歷及在學(xué)期間所取得的科研成果
致謝



本文編號：3437771