植物體內依賴于RNA的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase,RDRs）可介導RNA沉默信號的放大,在植物病毒防御反應中起著至關重要的作用。與煙草屬中其他種類的相比,本氏煙（Nicotianabenthamiana）對病毒侵染表現(xiàn)出超敏感,通常會表現(xiàn)出更為嚴重的病毒癥狀。有研究表明本氏煙NbRDR1m（NicotianabenthamianaRNA dependent RNA polymerase 1 mutant）編碼區(qū)的開放閱讀框架內有一段72個堿基的插入片段,該插入片段造成開放閱讀框架的提前終止而不能得到全長且有功能的NbRDR1蛋白可能是造成其對病毒侵染超敏感的主要原因。但該猜測并未得到證實。為了確證這一猜測,我們首先通過融合PCR技術去除NbRDR1m中72個插入堿基,將NbRDR1m恢復至NbRDR1的原型。然后將該原型NbRDR1構建雙元載體并轉化至野生型本氏煙中創(chuàng)制過表達NbRDR1的轉基因株系。通過抗生素篩選和基因組PCR,鑒定出轉基因株系并采用半定量RT-PCR分析各轉基因株系NbRDR1的表達情況。隨機挑選2個表達量較高和一個表達量... 

【文章來源】：浙江師范大學浙江省

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞
第一章 文獻綜述
    1 基因沉默
    2 RDRs
        2.1 RNA病毒
        2.2 植物體內的RDRs
        2.3 病毒與宿主植物侵染與反侵染之間的較量
    3 RDRs的研究進展
        3.1 擬南芥中的RDRs
        3.2 煙草中RDRs的研究進展
        3.3 馬鈴薯RDR1的研究進展
    4 本研究的目的和主要研究內容
第二章 實驗材料與方法
    1 實驗材料
        1.1 植物材料
        1.2 載體和菌株
        1.3 供試病毒
        1.4 實驗儀器和試劑
    2 實驗方法
        2.1 本氏煙總RNA的提取與檢測
        2.2 融合PCR技術構建無72個堿基插入的NbRDR1基因
            2.2.1 cDNA的產生
            2.2.2 目的基因的獲得
            2.2.3 目的基因的純化
        2.3 pCambia 2300S載體的構建
            2.3.1 引物設計
            2.3.2 將NbRDR1基因克隆至pCambia 2300S載體
        2.4 質�；蚪MDNA的提取
        2.5 轉基因本氏煙的轉化
            2.5.1 MS (Murashige and Skoog)培養(yǎng)基的配置
            2.5.2 無菌本氏煙的培養(yǎng)
            2.5.3 含目的載體菌液的獲得
            2.5.4 預培養(yǎng)
            2.5.5 侵染暗培養(yǎng)
            2.5.6 洗滌及篩選
            2.5.7 繼代培養(yǎng)
            2.5.8 生根培養(yǎng)
            2.5.9 煉苗培養(yǎng)
        2.6 轉基因本氏煙株系的鑒定
            2.6.1 鑒定引物的設計
            2.6.2 轉基因本氏煙再生植株基因組DNA的提取
            2.6.3 轉基因再生株系的PCR鑒定
            2.6.4 轉基因再生株系的RTPCR鑒定
        2.7 轉基因本氏煙煙草再生株系病毒侵染鑒定
            2.7.1 T1代轉基因植株的獲得
            2.7.2 T1代轉基因植株對病毒的抗性鑒定
第三章 結果與分析
    1 pCambia 2300S-NbRDR1載體的構建
        1.1 融合PCR技術構建無72個堿基插入的NbRDR1基因
        1.2 將目的基因克隆至pCambia 2300S-NbRDR1載體
    2 過表達NbRDR1轉基因本氏煙株系的創(chuàng)制
    3 轉基因再生株系的分子鑒定
        3.1 轉基因再生株系的基因組PCR鑒定
        3.2 轉基因本氏煙再生株系的RTPCR分析
    4 轉基因本氏煙株系病毒侵染的抗病性鑒定
        4.1 過表達NbRDR1可增強本氏煙對TMV-GFP的抗性
        4.2 過表達NbRDR1可增強本氏煙對非煙草屬病毒TuMV-GFP及PVX-GFP的抗性
第四章 討論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Viral suppression of RNA silencing[J]. JIANG Lin, WEI ChunHong & LI Yi * State Key Laboratory of Protein and Plant Gene Research, College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China.  Science China（Life Sciences）. 2012(02)
[2]轉錄后基因沉默——植物抵御外來病毒入侵的一種機制[J]. 馮德江,劉翔,朱禎.  遺傳學報. 2003(06)



本文編號：3433283