褐飛虱Nilaparvata lugens是水稻的重要害蟲之一.本研究旨在擴(kuò)增褐飛虱乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase,AChE）基因的啟動子,并從表觀遺傳學(xué)的角度探討DNA甲基化與褐飛虱生物型進(jìn)化間的關(guān)系.采用染色體步移（genome walking）方法擴(kuò)增AChE啟動子,根據(jù)所得啟動子序列設(shè)計甲基化特異性PCR（MS-PCR）引物和重亞硫酸鹽測序法BSP引物,分析褐飛虱生物型Ⅰ和生物型Ⅱ中AChE啟動子的甲基化程度,然后利用熒光定量PCR技術(shù)檢測AChE的表達(dá)水平差異.結(jié)果表明,擴(kuò)增得到褐飛虱AChE上游側(cè)翼DNA序列長度為1 919 bp,啟動子元件分析顯示,AChE啟動子區(qū)域中有若干與MYB、WRKY、ARE等抗性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)（元件）,表明該啟動子可能與逆境脅迫相關(guān).基于甲基化水平的限制酶酶切位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn),AChE啟動子區(qū)域含有多個^5mCG甲基化位點(diǎn),表明該區(qū)域DNA甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶的C-5位.MS-PCR分析表明,生物型Ⅰ褐飛虱AChE啟動子區(qū)域的甲基化程度高于生物型Ⅱ; BSP結(jié)果顯示生物型Ⅰ啟動子區(qū)域總體平均甲基... 

【文章來源】：湖北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2020,42(04)

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

TAIL PCR擴(kuò)增結(jié)果

以亞硫酸氫鹽處理后的生物型Ⅰ和生物型Ⅱ基因組DNA為模板進(jìn)行MS-PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示．泳道1和2分別為生物型Ⅰ和生物型Ⅱ的ACh E啟動子區(qū)未發(fā)生甲基化位點(diǎn)擴(kuò)增條帶;3和4分別為生物型Ⅰ和生物型Ⅱ的ACh E啟動子區(qū)發(fā)生甲基化-位點(diǎn)擴(kuò)增條帶．從圖中1和2看出生物型Ⅱ能擴(kuò)增出明顯的非甲基化條帶而生物型Ⅰ中擴(kuò)增出非甲基化條帶較淺，從3和4看出生物型Ⅰ能擴(kuò)增出明顯的甲基化條帶而生物型Ⅱ中擴(kuò)增出甲基化條帶不明顯，說明在生物型Ⅰ和生物型Ⅱ的ACh E啟動子中甲基化程度存在差異，且生物型Ⅰ的甲基化程度明顯高于生物型Ⅱ．兩種生物型兩對引物均擴(kuò)增出條帶，表明該Cp G位點(diǎn)只部分發(fā)生甲基化．?dāng)U增得到的啟動子序列通過網(wǎng)站(http://www.takara-bio.co.jp/enzyme/enzyme＿search.php)進(jìn)行啟動子區(qū)域受甲基化影響的限制酶酶切位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示褐飛虱ACh E啟動子區(qū)域主要甲基化酶切位點(diǎn)為Cp G methylase(5 mCG)，表明褐飛虱ACh E啟動子區(qū)域DNA甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶的C-5位．

以亞硫酸氫鹽處理后的生物型Ⅰ和生物型Ⅱ基因組DNA為模板進(jìn)行BS-PCR擴(kuò)增，1～4均為Ⅰ型褐飛虱BSP擴(kuò)增產(chǎn)物;5～8均為Ⅱ型褐飛虱BSP擴(kuò)增產(chǎn)物．結(jié)果如圖3所示:目的片段經(jīng)膠回收純化，連接p Clone007-T載體，菌落PCR驗(yàn)證后每種生物型均挑取10個陽性克隆子送至武漢擎科生物公司測序．根據(jù)測序結(jié)果利用在線網(wǎng)站(http://quma.cdb.riken.jp/)分析獲得兩種生物型ACh E啟動子區(qū)Cp G島的甲基化情況，并繪制黑白點(diǎn)圖(圖4和圖5).


本文編號：3406706