發(fā)布時(shí)間：2021-09-22 18:07

　　TCA循環(huán)是需氧生物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的代謝途徑,是機(jī)體利用糖或其他物質(zhì)氧化而獲得能量的最有效方式。檸檬酸合酶,作為TCA循環(huán)的限速酶,參與細(xì)胞內(nèi)多種生理過程,如:線粒體能量代謝、種子萌發(fā)和抗逆等,在醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)上具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。小麥條銹菌是一種活體營養(yǎng)專性寄生真菌,必須依賴侵染結(jié)構(gòu)—吸器從寄主中獲取營養(yǎng)。解析條銹菌的營養(yǎng)代謝過程,對于小麥條銹病的防控具有重要意義。大量的研究已經(jīng)表明,檸檬酸合酶在病菌的生長發(fā)育及致病過程中起重要作用,然而,目前關(guān)于檸檬酸合酶在小麥條銹菌侵染過程中作用的研究尚未見報(bào)道�；诖�,本研究對小麥條銹菌檸檬酸合酶基因進(jìn)行克隆表達(dá)及功能鑒定,具體結(jié)果如下:通過生物信息學(xué)分析及PCR技術(shù),成功克隆獲得一條具有完整ORF的小麥條銹菌檸檬酸合酶基因,命名為PsCS1,其全長為1407bp,編碼491個(gè)氨基酸,具有檸檬酸合酶的保守結(jié)構(gòu)域;利用qRT-PCR對PsCS1在條銹菌侵染過程中的表達(dá)特征進(jìn)行分析,PsCS1在條銹菌侵染早期上調(diào)表達(dá);通過原核表達(dá)證明其具有檸檬酸合酶的功能;酶學(xué)活性分析顯示:該酶在低溫時(shí)酶活力較高,最適pH為8,K⁺能顯著提高檸檬... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

影響三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵步驟(Simcocketal.2011)Fig1TCAcycleactivity-catalyticefficiency

第二章PsCS1基因的克隆及功能分析212.3結(jié)果分析2.3.1總RNA分析提取小麥與條銹菌混合的葉片總RNA，RNA溶液的A260/A280比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1，經(jīng)核酸濃度檢測儀檢測該值介于1.8到2.0之間；1.2%瓊脂糖凝膠跑膠檢測表明提取的RNA比較好，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，可用于下一步實(shí)驗(yàn)分析（圖2-1）。圖2-11.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測小麥葉片總RNAFig2-1IdentificationoftotalRNAbyagarosegelelectrophoresis2.3.2PsCS1基因克隆以總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，對候選靶標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)引物后對其進(jìn)行擴(kuò)增，用1％瓊脂糖凝膠跑膠檢測PCR產(chǎn)物。結(jié)果如圖：在約1000-2000bp中間有一條特別亮的DNA擴(kuò)增條帶，大小與生物信息學(xué)分析的序列相一致，并將該基因命名為PsCS1。圖2-2PCR擴(kuò)增PsCS1基因Fig2-2PCRamplificationofPsCS1gene2.3.3序列分析2.3.3.1DNA序列分析PsCS1基因片段經(jīng)回收純化、連T-vector、轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)cell，挑選經(jīng)菌落PCR鑒定正確的單一菌斑，送楊凌奧科進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，該基因由1407個(gè)堿基組成，包含完整的開放閱讀框，共編碼491個(gè)氨基酸殘基。

第二章PsCS1基因的克隆及功能分析212.3結(jié)果分析2.3.1總RNA分析提取小麥與條銹菌混合的葉片總RNA，RNA溶液的A260/A280比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1，經(jīng)核酸濃度檢測儀檢測該值介于1.8到2.0之間；1.2%瓊脂糖凝膠跑膠檢測表明提取的RNA比較好，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，可用于下一步實(shí)驗(yàn)分析（圖2-1）。圖2-11.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測小麥葉片總RNAFig2-1IdentificationoftotalRNAbyagarosegelelectrophoresis2.3.2PsCS1基因克隆以總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，對候選靶標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)引物后對其進(jìn)行擴(kuò)增，用1％瓊脂糖凝膠跑膠檢測PCR產(chǎn)物。結(jié)果如圖：在約1000-2000bp中間有一條特別亮的DNA擴(kuò)增條帶，大小與生物信息學(xué)分析的序列相一致，并將該基因命名為PsCS1。圖2-2PCR擴(kuò)增PsCS1基因Fig2-2PCRamplificationofPsCS1gene2.3.3序列分析2.3.3.1DNA序列分析PsCS1基因片段經(jīng)回收純化、連T-vector、轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)cell，挑選經(jīng)菌落PCR鑒定正確的單一菌斑，送楊凌奧科進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，該基因由1407個(gè)堿基組成，包含完整的開放閱讀框，共編碼491個(gè)氨基酸殘基。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]檸檬酸合酶的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 葛亞東,潘蔚,汪劼,朱國萍.  生物學(xué)雜志. 2010(03)
[2]煙草檸檬酸合成酶基因的克隆及其光誘導(dǎo)型植物表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 胡清泉,王奇峰,李昆志,陳麗梅,玉永雄.  草業(yè)學(xué)報(bào). 2009(04)
[3]香蕉檸檬酸合酶基因MaGCS的克隆及生物信息學(xué)分析[J]. 遲光紅,周雪麗,李美英,徐碧玉,金志強(qiáng).  熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué). 2009(08)



本文編號：3404166