水稻是世界上超過一半的人口的主要糧食作物,而由黃單胞桿菌水稻變種（Xanthomonas oryzae pv.oryzaae,Xoo）引起的水稻白葉枯�。˙acterial blight,BB）是影響其產(chǎn)量的主要病害之一。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是與植物抗病密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,對其研究不僅有助于我們了解植物抗病防御反應(yīng)機(jī)制,并且能為傳統(tǒng)育種和基因工程育種提供基因資源和相關(guān)理論指導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中,發(fā)現(xiàn)一個抗病相關(guān)基因OsWRKY28。此外,近年來,CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其定點(diǎn)突變效率高被成功運(yùn)用于多種物種的基因編輯中。本研究圍繞測試改造后的CRISPR/Cas9系統(tǒng)效率和分析OsWRKY28基因的功能展開,研究的內(nèi)容主要如下:1.CRISPR/Cas9載體改造及應(yīng)用其編輯水稻D3基因以測試效率以現(xiàn)有水稻CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)為起點(diǎn),優(yōu)化改造了相應(yīng)的載體及其構(gòu)建方法,實(shí)現(xiàn)了兩步法構(gòu)建基因編輯載體。利用新的載體和方法,針對水稻日本晴（Oryza sativa L.spp.Japonicaa cv.Nipponbare）D3 基因的 3 個靶向位點(diǎn)分別構(gòu)建了相應(yīng)的CRISPR/Ca... 

【文章來源】：浙江師范大學(xué)浙江省

【文章頁數(shù)】：112 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２．３水稻歷基因結(jié)構(gòu)及ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９靶位點(diǎn)示意圖??

校遙?茫幔螅乖靨逵嘔?壩τ悶潯嗉??荊冢諄?潁崳?方式Ｍｕｔａｎｔｌ為缺失八個堿基（ＣＡＧＴＴＧＣＧ）；總突變率為２９．２３％，共產(chǎn)生１１種??突變。具體突變方式如圖２．４所示。??Ａ?ＤＤＲＣＫ１１／３１）??ＣＫｉＡＣｉＴＡＣｉＡＣＴｎＣ＇ＧＣＣＣＡＴＣＫｉＣＧＧ?ＷＴ??ＧＧＡＣｉＴＡ（ｉＡＣ（ｎＣ（ｊＣＣＣ—（ＫｉＣＧＧ?Ｍｕｔａｎｔ?１??ＣＫｉＡＧＴＡＣｉＡＣＧＲＸｉＣＣＣ－ＴＣＫｉＣＧＧ?Ｍｕｔａｎｉ２??（ｉＣｉＡＣｎＡ（ｉＡＣ（ｉＴＣ（ｉＣＣＣＡＴＴ（ｉＧＣＧＧ?Ｍｕｔａｎｔ？??ＣｉＧＡＧＴＡＣｉＡＣＣｉＴＣＣｉＣＣＣＡＧＴＣｉＧＣＧＧ?Ｍｕｔａｎｔ４??ＧＧＡＧ１ＡＧＡＣＧ１ＣＧＣＣＣＡＡＴＧＧＣＧＧ?Ｍｕｉａｎｌ５??Ｂ?ＤＤＲＣ２（６／２４）??ＣＣＣＴＵＣＡ（ｉＴ（；ＴＴ（；ＣＡＡＡＴ（ｉＧＣＡＣ?ＷＴ??ＣＣＣＴＧＣＡＧ１ＣＪ?ＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣ?Ｍｕｌａｎｔ?１??ＣＣＣ１ＧＣ?ＣＴ１?ＴＯＣＡＡＡｒＧＧＣＡＣ?Ｍｉｎａｉｎ２??ＣＣＣＴＧＣ?ＡＧＴ—ＴＧＣ?ＡＡＡＴＧＧＣ?ＡＣ?Ｍｕｉａｎｉ？??ＣＣＣＴＧＣＡＧ—ＴＴ（＇ｊＣＡＡＡＴ（｝（ｉＣＡＣ?Ｍｍａｍ４??ＣＣＣＴＧＣＡ?ＴＧＣ?ＡＡＡＴＧＧＣ?ＡＣ?Ｍｕｔａｎｔ？??Ｃ?ＤＤＲＣ３（２／１０）??ＧＣＧＧＧＡＣ＇ＡＩＧＣ＇ＡＧＴＴＧＣＧＧＧＡＧＧ?ＷＴ??（＇．ＣＣＫＫＪＡＣＡＴＧ?ＧＣ５ＡＧＧ?Ｍｕｉａｎｌ?１??圖２．４?ＴＱ代轉(zhuǎn)基因植株具體突變類型??Ｆｉｇｕｒｅ?２．４?Ｔｈｅ?ｍｕｔａｔｉｏｎ?ｔｙｐｅ?ｏｆ?Ｔ〇?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｌｉｎｅｓ??圖中綠色序列表示ＰＡＭ位點(diǎn)

?：?ｔ?ＨＩ??Ａｍａａ／Ｖ＼ａ／＼Ａ?ｍ／Ｗ＼??圖２．５?Ｔ，代轉(zhuǎn)基因植株的測序結(jié)果??Ｆｉｇｕｒｅ?２．５?Ｔｈｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?Ｔｊ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｌｉｎｅｓ??圖Ａ為株系ａ：ＤＤＲＣｌ（Ｍｕｔａｎｔｌ）純合突變植株ａｌ、ａ２的測序結(jié)果；圖Ｂ為株系??ｂ：ＤＤＲＣｌ（Ｍｕｔａｎｔ３）純合突變植株ｂｌ的測序結(jié)果；圖Ｃ為株系ｃ：ＤＤＲＣ２（Ｍｕｔａｎｔ２）純合突變??植株ｃｌ的測序結(jié)果；圖Ｄ為株系ｄ：ＤＤＲＣ３（Ｍｕｔａｎｔｌ）純合突變植株ｄｌ、ｄ２的測序結(jié)果。??Ａ，?ｔｈｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ?ｍｕｔａｎｔ?ｐｌａｎｔｓ?ａｌａｎｄ?ａ２?ｏｆ?ｔｈｅ?ＤＤＲＣ１?（Ｍｕｔａｎｔ?１）；?Ｂ，??ｔｈｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ?ｍｕｔａｎｔ?ｐｌａｎｔ?ｂｌ?ｏｆ?ＤＤＲＣｌ（Ｍｕｔａｎｔ３）；?Ｃ，?ｔｈｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ??ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ?ｍｕｔａｎｔ?ｐｌａｎｔ?ｃｌ?ｏｆ?ＤＤＲＣ２（Ｍｕｔａｎｔ２）；?Ｄ，?ｔｈｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｔｈｅ??ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ?ｍｕｔａｎｔ?ｐｌａｎｔｓ?ｄｌａｎｄ?ｄ２?ｏｆ?ＤＤＲＣ３（Ｍｕｔａｎｔｌ）．??２．３．３轉(zhuǎn)基因水稻突變體植株表型鑒定??如表２．４與圖２．７所示，３周齡乃代純合突變植株中，ａｌ、ａ２對應(yīng)的的靶位??點(diǎn)為ＤＤＲＣ１，突變方式為缺失兩個堿基（ＡＴ），與野生型日本晴相比，株高及分??蘗數(shù)都沒有明顯變化；ｂｌ對應(yīng)的靶位點(diǎn)為ＤＤＲＣ１

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3392716