大豆疫霉（Phytophthora sojae）侵染大豆引起的大豆根腐病是大豆生產(chǎn)上的一種毀滅性病害。在形態(tài)學(xué)和生理學(xué)上,疫霉菌類似于高等絲狀真菌,但在進化上歸于包含硅藻屬和褐藻屬等藻類的茸鞭生物界,這種差別直接導(dǎo)致許多針對真菌的殺菌劑對疫霉病的防治沒有效果。疫霉菌由于是二倍體且基因同源重組率極低,在過去相當(dāng)長時間里,只能利用RNA干擾技術(shù)（基因沉默）研究基因的功能,由于沉默水平不可預(yù)測且往往不理想,篩選沉默轉(zhuǎn)化子費時費力,效率很低。最近,Tyler等報道了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在大豆疫霉基因組定點編輯中的成功應(yīng)用,該系統(tǒng)只需合成一個sgRNA和Cas9就能實現(xiàn)對基因的特異性修飾,操作簡單,顯著提高了疫霉菌基因功能的研究效率。轉(zhuǎn)錄因子是基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子,在病原菌致病等相關(guān)生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。實驗室前期對一個MADS-box轉(zhuǎn)錄因子PsMAD1進行研究,發(fā)現(xiàn)沉默該基因影響大豆疫霉游動孢子產(chǎn)量、致病力和對各種外界脅迫的應(yīng)答,為進一步驗證該轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能,本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對PsMAD1進行敲除,得到三個敲除突變體（T57、T69、T94）。對... 

【文章來源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

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?１?ＨＳＰ７０?ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ?ＮＰＴ?ＩＩ?ＲＰＬ４１?ｐｒｏｍｏｔｅｒ??＾??ｐＹＦ２－ＰｓＮＬＳ－ｈＳｐＣａｓ９??圖１－１?ＺｚｉＳＰＣｏｖＰ表達載體；＾意圖??Ｆｉｇ．?１－１?Ｔｈｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｈＳＰＣａｓ９?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｐｌａｓｍｉｄ?（Ｆａｎｇ?ａｎｄ?Ｔｙｌｅｒ，?２０１６）??１．３．２?ｓｇＲＮＡ載體構(gòu)建??在大豆疫霉屮，我們以ＲＰＬ４１為啟動子，用ＲＮＡ聚合酶ＩＩ調(diào)控元件來調(diào)控ｓｇＲＮＡ??的轉(zhuǎn)染。ｓｇＲＮＡ的５’端和３’端要有核糖酶來除去ｓｇＲＮＡ周丨丨移余的核苷酸，從而確??保ｓｇＲＮＡ的準(zhǔn)確仲，閣屮剪刀的位ＷＪ猶圮相應(yīng)的核掂＿切割位點。我們設(shè)計粑序列??引物時，根據(jù)２０ｂｐ的祀序列（圖１－２紅色標(biāo)記），ＨＨ核掂酶冊六個核苷酸設(shè)計得與??ｓｇＲＮＡ序列的前六個核苷酸反向互補，如閣１－２中紫標(biāo)記堿站序列所示。閣１－２中??綠色標(biāo)記的堿基序列表示構(gòu)建載休時Ｎｈｅ?１和Ｂｓａ?Ｉ的響Ｗ位點。??２７??

八導(dǎo)致游動孢子釋放受到影響，三個敲除突變體在孢子囊形成后的２４小時內(nèi)，??增加換水次數(shù)或４°Ｃ冷刺激３０分鐘再轉(zhuǎn)入２５°Ｃ培養(yǎng)箱培養(yǎng)，敲除突變休均??不釋放游動孢子（圖１－７?Ａ）。我們分時叫段對換水；ｒｉ孢子？鹿數(shù)景進行計數(shù)（圖１－７?Ｂ），??發(fā)現(xiàn)野生型ＷＴ和對照尚株ＣＫ在換水Ｐ?９?ｈ孢子？鹿數(shù)Ｍ達到Ｍ人值，｜ｆｌｊ＇作＿／）／敲??除突變體的孢子囊數(shù)量隨符時Ｎ的推移而增加。結(jié)災(zāi)顯爾的敲除影響游動孢??子的釋放，改變了孢子囊的萌發(fā)方式。??３９??


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