柞蠶（Antheraea pernyi）最早在中國山東地區(qū)發(fā)現(xiàn)并開始養(yǎng)殖馴化,是我國重要的一類野生絹絲昆蟲。絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpin）在昆蟲的先天免疫中通過與絲氨酸蛋白酶相互制約達(dá)到一定的動態(tài)平衡,從而調(diào)節(jié)生物體內(nèi)很多的生命活動,在昆蟲的先天免疫中發(fā)揮重要的作用。本文主要研究serpin-1like基因的表達(dá)模式和在柞蠶先天免疫中的功能,研究結(jié)果如下:本研究利用PCR技術(shù)成功克隆并獲得一個讀碼框?yàn)?37 bp的serpin-1like基因,其含有一個保守的serpin結(jié)構(gòu)域,進(jìn)化樹分析顯示其與印度柞蠶親緣關(guān)系最近,同源性高達(dá)為82.1%。通過構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-Ap-serpin-1like,并經(jīng)不同濃度IPTG誘導(dǎo)成功獲得了重組pET-28a-Ap-serpin-1like蛋白。大量誘導(dǎo)后使用蛋白純化柱對重組蛋白進(jìn)行純化,得到濃度和純度都非常高的pET-28a-Ap-serpin-1like蛋白,蛋白濃度約為0.5mg/ml。以獲得的重組蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔,通過實(shí)驗(yàn)室常規(guī)取血方法取血得到Ap-serpin-1like抗體并檢測效價約為1:128000。利用... 

【文章來源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

柞蠶脂肪體總RNA分析

圖 4-2 柞蠶 Ap-serpin-1like 蛋白的進(jìn)化樹分析Fig. 4-2 Phylogenetic analysis based on the Ap-serpin-1like amino acid sequences from various species.用于構(gòu)建進(jìn)化樹的 Ap-serpin-1like 蛋白的物種為：蓓帶夜蛾(Mamestra configurata) 甘藍(lán)夜蛾(Mamestrabrassicae) 天蠶蛾(Lonomia obliqua) 柑橘鳳蝶(Papilio xuthus) 棉鈴蟲(Helicoverpa armigera) 金鳳蝶(Papiliomachaon) 大紅斑蝶(Danaus plexippus) 小菜蛾(Plutella xylostella) 紅帶袖蝶(Heliconius melpomene) 藝神袖蝶(Heliconius erato) 二化螟(Chilo suppressalis) 冬尺蠖蛾(Operophtera brumata) 臍橙螟(Amyelois transitella)印度柞蠶(Antheraea mylitta) 家蠶(Bombyx mori) 野桑蠶(Bombyx mandarina) 煙草天蛾(Manduca sexta) 亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis) 玉帶鳳蝶(Papilio polytes) 云杉蚜蟲(Choristoneura fumiferana)表 4-1 柞蠶 serpin-1like 同源性分析Table. 4-1 Homology matrix of Antheraea pernyi serpin-1like1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121 100%2 82.1% 100%3 57.4% 58.0% 100%4 62.3% 64.1% 60.2% 100%5 56.3% 58.0% 91.3% 62.0% 100%6 53.7% 51.0% 63.7% 58.1% 67.3% 100%7 48.0% 44.8% 54.1% 58.1% 57.1% 56.0% 100%8 51.1% 50.7% 58.2% 57.3% 60.7% 61.6% 54.7% 100%

（Manduca sexta）5.甘藍(lán)夜蛾（Mamestra brassicae）6.棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）7.小菜蛾（Plutellaxylostella）8.玉米螟（Ostrinia furnacalis）9.野桑蠶（Bombyx mandarina）10.云杉蚜蟲（Choristoneura fumiferana）11.黑脈金斑蝶（Danaus plexippus）12.臍橙螟（Amyelois transitella）4.2.2 Ap-serpin-1like 蛋白的信號肽分析 由于用 SignalP 網(wǎng)絡(luò)在線的方法對信號肽的預(yù)測十分準(zhǔn)確，本實(shí)驗(yàn)也采取此方法對 Ap-serpin-1like 的信號肽進(jìn)行預(yù)測，該軟件利用隱馬爾可夫模型(HMM)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(NN)兩種方法預(yù)測分析。結(jié)果顯示 Ap-serpin-1like 第 1 至 18 氨基酸殘基為信號肽，如圖 4-3 所示：

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]ApNPV誘導(dǎo)柞蠶脂肪體和中腸組織中3個脂肪酶基因的表達(dá)及表達(dá)載體構(gòu)建[J]. 方素云,韓焱,李文利.  蠶業(yè)科學(xué). 2014(04)
[2]柞蠶Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑ApKTSPI基因克隆及表達(dá)特征分析[J]. 王磊,邱建烽,錢岑,朱保建,劉朝良.  應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào). 2014(04)
[3]白紋伊蚊唾液腺serpin1基因的可變剪接分析與原核表達(dá)[J]. 程金芝,孫宇,陳璐,劉鑒,吳家紅.  中國人獸共患病學(xué)報(bào). 2014(05)
[4]野桑蠶serpin2基因的克隆及轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析[J]. 盛東峰,張永亮,趙錦慧,胡春紅.  華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2013(04)
[5]Maspin與p53在宮頸鱗癌中的表達(dá)及相關(guān)性分析[J]. 方世蘭,嚴(yán)倩,張永欣,陳明霞.  中國婦產(chǎn)科臨床雜志. 2009(05)
[6]家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑基因serpin-6的克隆、序列分析和組織表達(dá)[J]. 劉襯麗,王東,李兵,管京敏,俞燕芳,査宏賢,許雅香,沈衛(wèi)德.  昆蟲學(xué)報(bào). 2009(01)
[7]柞蠶功能基因研究進(jìn)展[J]. 劉彥群,姜德富.  蠶業(yè)科學(xué). 2008(03)
[8]絲氨酸蛋白酶抑制劑和血管內(nèi)皮生長因子基因在口腔鱗癌中的表達(dá)[J]. 張雷,唐曕貴,仝向娟.  中華口腔醫(yī)學(xué)雜志. 2004(05)
[9]絲氨酸蛋白酶SNC19及其抑制因子在胃癌中的表達(dá)[J]. 曾蕾,曹江,張行.  中華消化雜志. 2004(07)
[10]絲氨酸蛋白酶抑制劑的研究及應(yīng)用[J]. 張梅,朱柞銘.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 1996(03)

博士論文
[1]家蠶Serpin家族蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)與功能研究[D]. 劉騁.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[2]家蠶先天免疫的模式識別、信號傳導(dǎo)和抗微生物肽基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究[D]. 許平震.西南大學(xué) 2010

碩士論文
[1]微生物誘導(dǎo)柞蠶血淋巴溶菌酶基因表達(dá)及分析[D]. 宋佳.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[2]柞蠶模式識別受體βGRP、immulectins基因的克隆及表達(dá)分析[D]. 李鳳娟.大連理工大學(xué) 2012
[3]柞蠶免疫相關(guān)因子Apdorsal的克隆、鑒定及表達(dá)分析[D]. 劉媛.大連理工大學(xué) 2011



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