【目的】從對根癌病具有獲得抗性（SAR）的桃單株"西北13-1"的枝條內(nèi)分離鑒定內(nèi)生細(xì)菌,分析其種群組成并從中篩選拮抗根癌土壤桿菌的高效生防菌,為桃根癌病的生物防治探索新方向并提供新的生防菌資源�！痉椒ā渴紫�,將根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）接種到"西北13-1"的桃樹枝條上,并以無菌水接種作為對照;然后,分別于接種前、接種后10 d和接種后60 d采集接種處理和對照處理的"西北13-1"枝條。表面消毒桃樹枝條樣品后采用涂布平板法分離內(nèi)生細(xì)菌;并結(jié)合16S r DNA序列鑒定,比對初步鑒定菌株,分析內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量及組成差異。采用平板拮抗法、溫室防病效果測定篩選拮抗根癌土壤桿菌的活性菌株,通過生理生化測定和分子鑒定,明確其分類地位。為揭示拮抗菌可能具有的其他拮抗作用機(jī)制,通過電擊轉(zhuǎn)化將含有GFP基因的p BBR1MCS-2質(zhì)粒導(dǎo)入拮抗菌株中,然后進(jìn)行GFP標(biāo)記菌株對根癌土壤桿菌的抑菌試驗(yàn)、生長動(dòng)力學(xué)分析、穩(wěn)定性測試。采用灌根法提前接種標(biāo)記菌株菌懸液,第2天接種根癌土壤桿菌菌懸液,應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡和平板稀釋法研究標(biāo)記菌株在番茄根部的定殖情況�！窘Y(jié)... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2017,50(20)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

不同處理枝條中內(nèi)Fig.2Differencesinthecompositionofendophytic

譜饔?Table1SuppressioneffectofantagonisticbacteriaongallformationcausedbyA.tumefaciensinsunflowers菌株Strain病情指數(shù)Diseaseindex防治效果Controlefficacy(%)10DM4-19.17±1.44b86.08±2.19a10DI2-26.67±5.77b89.87±8.77a10DM4-1-gfp13.33±2.89b79.74±4.39a10DI2-2-gfp5.83±5.20b91.14±7.90aCK65.83±3.82a—數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（P≤0.05）Differentlowercasesfollowingthedataindicatedsignificantdifference(P≤0.05)A:CK;B:10DM4-1;C:10DI2-2;D:10DM4-1-gfp;E:10DI2-2-gfp圖3拮抗菌對根癌土壤桿菌侵染向日葵形成根癌瘤的抑制作用Fig.3SuppressioneffectofantagonistsoncrowngallformationcausedbyA.tumefaciensinsunflowerseedlings2.2.2拮抗菌的菌落形態(tài)和生理生化特性菌株10DM4-1在NA培養(yǎng)基上的單菌落圓形扁平，呈黃色，表面光滑，邊緣整齊。革蘭氏染色陰性，接觸酶反應(yīng)陽性，不水解明膠等。根據(jù)菌體形態(tài)特征、生化特性及Biolog測定結(jié)果（表2），初步判定10DM4-1為Pantoeadeleyi[28-30]。菌株10DI2-2在NA培養(yǎng)基上的單菌落圓形中凸，呈淡黃色，表面光滑黏稠。革蘭氏染色陰性，能水解七葉靈等。根據(jù)菌體形態(tài)特征、生化特性及Biolog測定結(jié)果（表3），初步判定10DI2-2為Enterobactercowanii[31-32]。2.2.316SrDNA序列測定及其系統(tǒng)發(fā)育分析菌株10DM4-1和10DI2-2的16SrDNA序列已提交至GenBank，登錄號分別為KY451836和KY451837。16SrDNA序列比對結(jié)果顯示，10DM4-1與P.deleyi（EF688011）相似性達(dá)98.94%，且與其在系統(tǒng)發(fā)育樹同一分支（圖4-A），結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性，將10DM4-1鑒定為P.deleyi。10DI2-2的16SrDNA序列與E.cowanii（AJ508303）序列相似性達(dá)99.56%，且與其?

3926中國農(nóng)業(yè)科學(xué)50卷A：10DM4-1-gfp的熒光顯微鏡觀察Fluorescencedetectionofstrain10DM4-1-gfpunderfluorescencemicroscope；B：10DI2-2-gfp的熒光顯微鏡觀察Fluorescencedetectionofstrain10DI2-2-gfpunderfluorescencemicroscope圖5轉(zhuǎn)化子的熒光檢測Fig.5Identificationoftransformantsbyfluorescenceunderfluorescencemicroscope后開始衰亡。熒光鏡檢結(jié)果表明連續(xù)轉(zhuǎn)接10次后，菌落仍然保持均勻而且強(qiáng)烈的綠色熒光，標(biāo)記菌株質(zhì)粒的穩(wěn)定性接近100%。10DM4-1、10DM4-1-gfp、10DI2-2和10DI2-2-gfp對根癌土壤桿菌形成的抑菌圈直徑（mm）分別為12.29±1.02a、13.41±0.52a、12.47±0.78a和13.44±0.94a，平板抑菌活性檢測及溫室防病效果測定（表1）的結(jié)果表明標(biāo)記菌株10DM4-1-gfp、10DI2-2-gfp分別與原始菌株10DM4-1、10DI2-2對根癌土壤桿菌的抑菌活性無明顯差異。結(jié)果證明外源質(zhì)粒的存在及GFP的表達(dá)未對菌株10DM4-1和10DI2-2的生理代謝、生防功能產(chǎn)生明顯的不利影響。2.4標(biāo)記菌株在番茄根際的定殖定殖試驗(yàn)結(jié)果表明，10DM4-1-gfp和10DI2-2-gfp灌根當(dāng)天的初始菌量接近108CFU/g，3d后種群數(shù)量迅速下降至106CFU/g，隨后下降速度稍緩，10d后種群數(shù)量約為104CFU/g，30d后標(biāo)記菌株仍然能被檢測到且數(shù)量級趨于穩(wěn)定，同樣約為104CFU/g。用蔡司激光共聚焦顯微鏡觀察到，灌根當(dāng)天10DM4-1-gfp和10DI2-2-gfp的綠色菌體大量定殖在番茄根圍，形成一層綠色的保護(hù)膜，處理3d后綠色菌體的數(shù)量迅速下降，標(biāo)記菌株大量進(jìn)入細(xì)胞間隙，10d及30d之后標(biāo)記菌株在番茄根部的定殖動(dòng)態(tài)變化不大，在30d后根部細(xì)胞間隙能明顯觀測到綠色菌群（圖6）。對照組在接種3d后沒有發(fā)現(xiàn)任何熒光，表明該番茄根組織沒有背景熒光。3討論植物內(nèi)生細(xì)菌指能

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