假單胞菌Pf-5（Pseudomonas protegens Pf-5）是一種重要的植物根際促生菌,能產(chǎn)生多種抑制植物病原菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物,是生物防治制劑研究模式菌株,分布及其廣泛,是植物根際環(huán)境中相對(duì)豐度很高的菌屬。假單胞菌Pf-5 retS mutant突變株是實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的工程菌株,通過突變假單胞菌Pf-5的retS基因從而提高了生物防治功能。斯氏假單胞菌DSM4166（Pseudomonas stutzeri DSM4166）全基因組序列已經(jīng)公布,固氮基因簇nif注釋清楚,能夠進(jìn)行生物固氮,但還沒有生物防治的有關(guān)報(bào)道。同時(shí)具備固氮和生防作用的菌株很少,為了獲得一株可廣泛分布的既固氮又生防的多功能根際促生細(xì)菌,本研究通過在Pf-5和Pf-5 retS mutant菌株中異源表達(dá)DSM4166的固氮基因簇nif,構(gòu)建了突變菌株P(guān)f-5-nif和Pf-5 retS mutant-nif,成功實(shí)現(xiàn)了固氮基因簇的異源表達(dá)。本研究主要結(jié)果總結(jié)如下:1、將DSM4166的固氮基因簇nif通過接合轉(zhuǎn)座的方式隨機(jī)插入到Pf-5和Pf-5 retS mutant基因組中。2、通過乙炔還原法篩選到... 

【文章來源】：山東大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

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離出的一類十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類聚酮化合物［６７１，通常以甲基丙二酰－ＣｏＡ或丙二酰－??ＣｏＡ為原料，最終生成的埃博霉素類化合物主要有四種，分別是ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅＡ、Ｂ、??Ｃ和Ｄ?（圖１－１）。埃博霉素和紫杉醇都是作用于胞內(nèi)微管蛋白的天然藥物，但是它??們的作用機(jī)制和結(jié)合位點(diǎn)存在差異。埃博霉素是和Ｐ微管蛋白Ｎ端的第２１７－２３１位??和第３１位氨基酸結(jié)合，通過促進(jìn)微管蛋白聚合，抑制解聚，使紡錘體不能正常發(fā)揮??功能，腫瘤細(xì)胞核不能正常分裂，細(xì)胞有絲分裂停留在Ｇ２－Ｍ期，導(dǎo)致細(xì)胞死亡１６８】。??０?ＯＨ?０?ＴＸＴ??Ｒ?＝?Ｈ?ｅｐｏｔｔｉｉｌｏｎｅ?Ａ?Ｒ?＝?Ｈ?ｅｐｏｔｈｉｌｏｎａ?Ｃ??Ｒ?＝?Ｍｅ?ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ?Ｂ?Ｒ?＝?Ｍｅ?ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ?０??圖１－１埃博霉素結(jié)構(gòu)示意圖??Ｆｉｇ．．?１－１?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ??埃博霉素基因簇序列全長約為５６?ｋｂ，包括７個(gè)轉(zhuǎn)錄方向一致的基因，９個(gè)模塊??和４６個(gè)結(jié)構(gòu)域＿。７個(gè)基因依次為ｅ／）〇．４，?ｅ／ｗｆｉ，?ｅ／ｗＣ，印〇Ａ�。迹澄澹々柺�??編碼５個(gè)聚酮合酶（ｅｐｏＪ，?＃ｏＣ－?Ｆ），包括９個(gè)ＰＫＳ模塊；１個(gè)非核糖體肽合成酶??（叩〇５），為１個(gè)ＮＰＫＳ個(gè)模塊；及１個(gè)細(xì)胞色素Ｐ４５０氧化酶（印〇尺）。埃博霉素??生物合成途徑共包括四個(gè)階段：①聚酮鏈的引發(fā)和噻唑環(huán)的合成：印〇４基因負(fù)貴編??碼加載模塊ｍｏｄｕｌｅ?Ｌ，獲得起始單元。下游緊鄰的ＮＲＰＳ模塊與ｍｏＪ共同催化??半胱氨酸和乙�；目s合

圖２－ｌ菌落ＰＣＲ驗(yàn)證假單胞菌《／／固氮基因簇及相應(yīng)的固氮酶活性。（Ａ）?？／／固氮基因簇示??Ｍ圖。４個(gè)箭頭處為４個(gè)保ｆ落ＰＣＲ處。（Ｂ）?ＰＣＲ產(chǎn)物瓊胎糖凝膠屯泳闡。ｂａｎｄｌ－４：?４個(gè)ＰＣ產(chǎn)物，目的條帶都在１?ｋｂ左右。Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ５０００，條帶大小依次為５０００，?３０００，??２０００，?１５００，?１０００，７５０，?５００，２５０，?１００；?１－５：做完接合轉(zhuǎn)移的?ｐｆ－５?單克隆菌落；Ｐｆ－５：??ｐｆ－５野生型，陰性對(duì)照；６－１０：做完接合轉(zhuǎn)移的Ｐｆ－５ｍＳ?ｍｕｔａｎｔ單克隆菌落；ｒｅＡＳ??ｍｕｔａｎｔ：?Ｐｆ－５?ｒｅｔＳ?ｍｕｔａｎｔ工程菌株，陰性對(duì)照；Ｐ：?固Ｍ基因族直接克隆質(zhì)粒，陽性對(duì)??照；ＤＳＭ４１６６：?ＤＳＭ４１６６野生型，陽性對(duì)照。（Ｃ）固氮酶活性測(cè)定結(jié)果。ＤＳＭ４１６６：??ＤＳＭ４１６６野生型，陽性對(duì)照。Ｍ／１－９為Ｂ中的丨－９，?Ｐｆ－５：?ｐｆ－５野生型，陰性對(duì)照。每組至測(cè)三次取平均值，條形代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。根據(jù)方差分析，＊＊ｐ＜０．０丨和＊＊＊ｐ＜０．００１，??Ｄｕｎｎｅｔｔ作為術(shù)后測(cè)試。??Ｆｉｇ．．?２－１?Ｇｅｎｏｍｉｃ?ＰＣＲ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｎｉｆ?ｇｅｎｅｓ?ａｎｄ?ｔｈｅ?ｒｅｌａｔｉｖｅ?ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｉｎ?Ｐ．?ｐｒｏｔｅｇｅｎｓ（Ａ）Ｎｉｆ?ｇｅｎｅｓ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｍａｐ．?Ｆｏｕｒ?ａｒｒｏｗｓ?ｗｅｒｅ?ｌｏｃａｔｅｄ?ａｔ?ｆｏｕｒ?ｃｏｌｏｎｙ?ＰＣＲ?ｓｉｔｅｓ．（Ｂ）Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅ２

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]自生固氮菌的固氮能力及其對(duì)春小麥生長發(fā)育的影響[J]. 盧秉林,王文麗,李娟,郭天文.  中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2009(05)
[2]抗癌新藥埃博霉素的研究與開發(fā)(二)[J]. 閻家麒,高榮,謝建平,周彬.  精細(xì)與專用化學(xué)品. 2008(06)
[3]根際微生態(tài)系統(tǒng)中豆科植物-根瘤菌共生固氮及其在可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展中的作用[J]. 劉永秀,張福鎖,毛達(dá)如.  中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào). 1999(04)



本文編號(hào)：3208064