Dicer是一種在進(jìn)化上高度保守的核糖核酸內(nèi)切酶,屬于RNase III家族的成員,可以特異識(shí)別并切割雙鏈RNA（double-stranded RNA,dsRNA）。在大部分昆蟲(chóng)中,Dicer分為兩個(gè)同源基因Dicer-1（Dcr-1）和Dicer-2（Dcr-2）,二者分別作用在RNAi的miRNA途徑和siRNA途徑,同時(shí)Dcr-1可以參與生物體的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控。目前,小菜蛾上的Dicer還未有具體研究。因此,本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)分別敲除小菜蛾Dcr-1（PxDcr-1）和Dcr-2（PxDcr-2）基因,分析其對(duì)小菜蛾的影響,明確其功能。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR擴(kuò)增拼接獲得PxDcr-1和PxDcr-2兩個(gè)基因,PxDcr-1的ORF為7524bp,編碼2507個(gè)氨基酸,PxDcr-2的ORF為5085bp,編碼1694個(gè)氨基酸,二者結(jié)構(gòu)域基本相同,都含有解螺旋結(jié)構(gòu)域、Dicer二聚體結(jié)構(gòu)域、N端結(jié)構(gòu)域、PAZ結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域。但是PxDcr-2相比PxDcr-1缺少Dicer-PBD（partner-binding domain of the endo-... 

【文章來(lái)源】：福建農(nóng)林大學(xué)福建省

【文章頁(yè)數(shù)】：72 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 Dicer的研究進(jìn)展
        1.1.1 Dicer的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.1.2 Dicer在 RNAi通路中的作用及原理
        1.1.3 Dicer的生理功能
    1.2 基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因敲除
    1.3 本研究的立題依據(jù)和意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 供試?yán)ハx(chóng)
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 基因敲除品系的構(gòu)建
        2.2.1 cDNA模板的獲得
        2.2.2 基因克隆
        2.2.3 基因特異性sgRNA的設(shè)計(jì)及體外轉(zhuǎn)錄
        2.2.4 Cas9的獲得
        2.2.5 胚胎的顯微注射和突變個(gè)體的篩選
        2.2.6 突變體品系的篩選及驗(yàn)證
    2.3 Dicer功能的研究
        2.3.1 敲除品系的形態(tài)學(xué)觀察及分析
        2.3.2 基于PxDcr-2敲除品系的RNAi
3 結(jié)果與分析
    3.1 Px Dcr-1和PxDcr-2的序列特征及靶點(diǎn)
    3.2 小菜蛾Dicer突變品系
        3.2.1 基因突變類(lèi)型
        3.2.2 突變品系
    3.3 Dicer突變對(duì)小菜蛾的影響
        3.3.1 對(duì)生殖的影響
        3.3.2 對(duì)生存和發(fā)育的影響
    3.4 PxDcr-2敲除對(duì)RNAi的影響
        3.4.1 對(duì)Pxyellow RNAi的影響
        3.4.2 對(duì)Pxwhite RNAi的影響
4 總結(jié)與討論
    4.1 Dicer與生殖及生長(zhǎng)調(diào)控
    4.2 Dcr-2與RNAi通路
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄A 主要儀器
    附錄B 小菜蛾Dicer序列
    附錄C 敲除品系篩選峰圖
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在HIV-1感染治療中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 韓英倫,李慶偉.  遺傳. 2016(01)
[2]CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)[J]. 方銳,暢飛,孫照霖,李寧,孟慶勇.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2013(08)
[3]Dicer結(jié)構(gòu)和功能研究進(jìn)展[J]. 彭杰軍,燕飛,陳海如,陳劍平.  遺傳. 2008(12)
[4]RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體中的生物大分子及其裝配[J]. 宋雪梅,燕飛,杜立新.  遺傳. 2006(06)

碩士論文
[1]小菜蛾RNAi通路核心元件的基因組篩選及PxDcr-2基因的功能驗(yàn)證[D]. 沈修婧.福建農(nóng)林大學(xué) 2016



本文編號(hào)：3204774