油菜菌核病是由核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary]引起的一種真菌性病害。該病害可發(fā)生在油菜的整個生育期,嚴重影響油菜產量與品質。二甲酰亞胺類殺菌劑菌核凈在我國用于防治油菜菌核病已有十幾年,目前部分地區(qū)已監(jiān)測到菌核凈的抗性菌株。本研究以室內誘導的菌核凈抗性菌株和田間抗性菌株為試驗材料,測定了室內誘導和田間抗性菌株菌核凈抗性水平的遺傳穩(wěn)定性,研究了室內誘導抗性菌株冷藏4年后的生物學特性;比較分析了田間菌核凈抗性與敏感菌株生理生化差異;通過PCR技術擴增組氨酸激酶HK基因Sshk、反應調控蛋白基因Sssk1、組氨酸磷酸轉移酶基因Ss Ypd和促分裂原活化蛋白激酶基因MAPK（Sssk2、Ss Pbs和Ss Hog）,并對其序列進行比對,應用RNAi技術研究核盤菌對菌核凈的抗性機理。主要研究結果如下:1.在PDA上連續(xù)培養(yǎng)20代后,田間菌核凈抗性菌株（HLJ3、HLJ4和HLJ6）的抗性可以穩(wěn)定遺傳,經4℃冷藏4年后,菌核凈抗性依然穩(wěn)定;而室內誘導抗性菌株（SCG7和LA50）的抗性在無藥PDA上逐漸衰退,冷藏4年后,對菌核凈的抗性分別下降了99... 

【文章來源】：華中農業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
第1章 前言
    1.1 核盤菌
    1.2 二甲酰亞胺類殺菌劑(DCFs)菌核凈
    1.3 核盤菌對苯并咪唑類及DCF類殺菌劑抗藥性研究進展
        1.3.1 核盤菌對苯并咪唑類殺菌劑的抗性
        1.3.2 核盤菌對DCFs的抗性
        1.3.3 核盤菌對苯并咪唑類殺菌劑的抗性機制
        1.3.4 核盤菌對DCFs的抗性機制
    1.4 雙組份信號傳導系統與MAPK級聯通路
        1.4.1 雙組份信號傳導系統
        1.4.2 絲狀植物病原真菌的雙組份信號傳導系統
        1.4.3 MAPK級聯通路
    1.5 根癌農桿菌介導真菌遺傳轉化
    1.6 RNA干擾(RNAi)技術
        1.6.1 RNAi作用機理
        1.6.2 RNAi介導真菌基因功能的研究
    1.7 立題依據與研究意義
    1.8 技術路線
第2章 菌核凈抗性遺傳穩(wěn)定性及室內誘導抗性突變體冷藏后的生物學特性
    2.1 材料和方法
        2.1.1 供試菌株
        2.1.2 藥劑
        2.1.3 儀器設備
        2.1.4 供試菌株活化
        2.1.5 藥液配制
        2.1.6 菌核凈抗性遺傳穩(wěn)定性測定
        2.1.7 菌核凈室內誘導抗性突變體冷藏后對其它藥劑的敏感性測定
        2.1.8 菌核凈室內誘導抗性突變體冷藏后產核能力、生長速率及致病性測定
        2.1.9 菌核凈室內誘導抗性突變體冷藏后滲透壓敏感性測定
        2.1.10 數據分析
    2.2 結果與分析
        2.2.1 菌核凈抗性的遺傳穩(wěn)定性
        2.2.2 菌核凈室內誘導抗性突變體冷藏后對其它藥劑的敏感性
        2.2.3 菌核凈室內誘導抗性突變體冷藏后產核、生長速率及致病性
        2.2.4 菌核凈室內誘導抗性突變體冷藏后滲透壓敏感性
    2.3 討論
第3章 核盤菌對菌核凈抗性生化機制研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 供試菌株
        3.1.2 藥劑及試劑
        3.1.3 儀器設備
        3.1.4 菌核凈抗性與敏感菌株的草酸含量測定
        3.1.5 菌核凈抗性與敏感菌株菌絲甘油含量測定
        3.1.6 菌核凈抗性與敏感菌株菌絲細胞膜通透性測定
        3.1.7 菌核凈抗性與敏感菌株POD和PPO活性測定
        3.1.8 數據分析
    3.2 結果與分析
        3.2.1 菌核凈抗性與敏感菌株的草酸含量
        3.2.2 菌核凈抗性與敏感菌株菌絲甘油含量
        3.2.3 菌核凈抗性與敏感菌株菌絲細胞膜通透性
        3.2.4 菌核凈抗性與敏感菌株的POD和PPO酶活性
    3.3 討論
第4章 核盤菌雙組份信號傳導及MAPK級聯相關基因克隆
    4.1 材料與方法
        4.1.1 供試菌株
        4.1.2 試劑
        4.1.3 儀器設備
        4.1.4 引物設計
        4.1.5 核盤菌基因組DNA、總RNA提取及第一鏈cDNA合成
        4.1.6 PCR(Polymerase Chain Reaction)擴增
        4.1.7 割膠回收
        4.1.8 連接
        4.1.9 大腸桿菌熱擊轉化
        4.1.10 數據分析
    4.2 結果與分析
        4.2.1 核盤菌雙組份信號傳導及MAPK級聯相關基因序列分析
        4.2.2 Sshk基因相對表達量分析
    4.3 討論
第5章 核盤菌Sshk轉錄水平對菌核凈抗性水平的影響研究
    5.1 材料和方法
        5.1.1 供試菌株
        5.1.2 供試質粒與載體
        5.1.3 試劑
        5.1.4 儀器設備
        5.1.5 引物設計
        5.1.6 核盤菌基因組DNA、總RNA提取及第一鏈cDNA合成
        5.1.7 質粒提取、雙酶切和割膠回收
        5.1.8 Sshk基因載體構建
        5.1.9 重組質粒熱擊轉化及電擊轉化
        5.1.10 農桿菌重組質粒鑒定
        5.1.11 農桿菌介導轉化核盤菌
        5.1.12 轉化子驗證
        5.1.13 轉化子對菌核凈敏感性測定
        5.1.14 轉化子生長速率及產核能力測定
        5.1.15 轉化子致病力測定
        5.1.16 轉化子對滲透壓敏感性及對H_2O_2的氧化應激測定
        5.1.17 轉化子細胞壁及細胞膜完整性測定
        5.1.18 轉化子對不同溫度敏感性測定
    5.2 結果與分析
        5.2.1 Sshk基因載體構建
        5.2.2 農桿菌重組質粒鑒定
        5.2.3 轉化子驗證
        5.2.4 轉化子對菌核凈的敏感性
        5.2.5 轉化子產核能力及生長速率
        5.2.6 轉化子的致病力
        5.2.7 轉化子對滲透壓敏感性
        5.2.8 轉化子對H_2O_2的氧化應激反應
        5.2.9 轉化子的細胞壁完整性
        5.2.10 轉化子的細胞膜完整性
        5.2.11 轉化子對不同溫度敏感性
    5.3 討論
第6章 總結與展望
    6.1 總結
    6.2 創(chuàng)新點
    6.3 展望
參考文獻
附錄Ⅰ 常用培養(yǎng)基及試劑配制
    1.1 常用培養(yǎng)基配制
    1.2 常用抗生素配制
    1.3 常用試劑配制
    1.4 感受態(tài)細胞制備
        1.4.1 E.coliDH5α感受態(tài)細胞制備
        1.4.2 農桿菌EHA105感受態(tài)細胞制備
附錄Ⅱ 攻讀博士學位期間發(fā)表論文
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]不同栽培模式及施氮方式對油菜產量和氮肥利用率的影響[J]. 劉波,魯劍巍,李小坤,叢日環(huán),吳禮樹,葉川,鄭偉,徐維明,姚忠清,任濤.  中國農業(yè)科學. 2016(18)
[2]野生大豆接種大豆疫霉根腐病菌后多酚氧化酶（PPO）活性變化[J]. 徐鵬飛,常敬禮,趙福華,唐鑫華,郭長軍,張淑珍.  大豆科學. 2012(01)
[3]病毒誘導的基因沉默技術及其在植物中的研究進展[J]. 張新華,李富軍.  西北植物學報. 2012(02)
[4]草莓枯萎病菌抗戊唑醇突變體ZY-W的生理生化特性[J]. 姜莉莉,王紅艷,夏曉明,林琎,王開運.  農藥學學報. 2012(01)
[5]江蘇省油菜菌核病菌對多菌靈和菌核凈的抗藥性監(jiān)測[J]. 匡靜,王建新,周明國.  中國農學通報. 2011(15)
[6]油菜菌核病菌抗腐霉利菌株的生理生化特性及抗藥機制初步分析[J]. 陳夕軍,曹敏娟,孔維文,王艷,童蘊慧,徐敬友.  中國油料作物學報. 2010(04)
[7]玉米灰斑病菌粗毒素對玉米胚根保護酶活性的影響[J]. 王桂清,張濤,孫華,徐秀德.  沈陽農業(yè)大學學報. 2010(02)
[8]應用RNA干擾技術創(chuàng)造低脂肪氧化酶活性大豆新種質[J]. 馬建,張君,曲靜,王云鵬,魏益凡,王丕武.  中國農業(yè)科學. 2009(11)
[9]用RNA干擾技術創(chuàng)造高直鏈淀粉馬鈴薯材料[J]. 郭志鴻,張金文,王蒂,陳正華.  中國農業(yè)科學. 2008(02)
[10]江蘇省油菜菌核病菌對多菌靈的敏感性[J]. 李偉,李偉,周益軍,陳懷谷.  中國油料作物學報. 2007(01)

博士論文
[1]核盤菌菌核形成相關蛋白Ss-Sl2功能研究[D]. 余洋.華中農業(yè)大學 2012

碩士論文
[1]核盤菌對二甲酰亞胺類殺菌劑菌核凈的抗性機理研究[D]. 肖翔.華中農業(yè)大學 2013
[2]核盤菌菌核形成相關基因的篩選及功能驗證[D]. 張敏.華中農業(yè)大學 2011
[3]油菜菌核病菌對多菌靈的抗藥性研究[D]. 徐文杰.華中農業(yè)大學 2011
[4]油菜菌核病菌對腐霉利的抗性及其機制[D]. 曹敏娟.揚州大學 2008
[5]農桿菌介導核盤菌菌絲轉化體系的建立及SsDRV下調基因Ss-CYP1的功能初步研究[D]. 江明.華中農業(yè)大學 2007
[6]絲狀真菌遺傳轉化系統的建立[D]. 周慶新.山東農業(yè)大學 2007
[7]灰葡萄孢對腐霉利的抗性及其機制研究[D]. 王艷.揚州大學 2007



本文編號：3198428