棉花不僅是我國(guó)人民衣著和紡織工業(yè)的主要原料,還是出口創(chuàng)匯的重要產(chǎn)品,關(guān)系國(guó)計(jì)民生,意義重大。而棉花黃萎病廣泛分布于世界五大洲的各產(chǎn)棉區(qū),嚴(yán)重威脅著棉花的可持續(xù)生產(chǎn)。黃萎病菌可通過突變、異核現(xiàn)象等引起變異,土壤、種子、病殘?bào)w、棉籽殼和棉籽餅等都可作其傳播途徑,這使其防治較為困難。目前,通過分子手段進(jìn)行抗病育種是防治該病害的理想措施。本研究制訂了棉花黃萎病的田間防治技術(shù)并在田間實(shí)驗(yàn)基地對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了防治效果鑒定;以抗黃萎病品種中植棉KV-3作為植物材料,以強(qiáng)致病力菌株大麗輪枝菌V991作為接種病菌,篩選抗黃萎病相關(guān)基因;利用RACE和電子克隆等技術(shù)得到抗病基因全長(zhǎng);通過亞細(xì)胞定位技術(shù)和超表達(dá)技術(shù)分析目的基因的定位及功能。取得結(jié)果如下:1.以不采取任何措施和只使用生防制劑拌種作對(duì)照,研究棉花黃萎病田間防治技術(shù)的防效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,采用生防制劑拌種、施加有機(jī)肥、噴施葉面肥和控制早鈴相結(jié)合的措施,具有防病增產(chǎn)效果。2.利用VIGS技術(shù)在中植棉KV-3中成功沉默了基因GhFLS2、GhMRH1、GhAGD13和GhWRKY29,對(duì)沉默植株進(jìn)行抗病性測(cè)定發(fā)現(xiàn),GhFLS2、GhMRH1、GhAGD1... 

【文章來源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：84 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

田間棉花黃萎病癥狀（簡(jiǎn)桂良攝）

農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第三章 VIGS 技術(shù)鑒定抗黃萎病相關(guān)分別摘取野生型、轉(zhuǎn)空載體 pCLCrV(A+B)、pCLCrV-GhAGD13 和 pCLCrV-GhWRKY29 葉菌水沖洗干凈后放入小燒杯中；向燒杯中加入苔盼藍(lán)染色液，用沸水煮 8-10 分鐘染色；液，用水合三氯乙醛溶液（2.5g/mL）脫色；完成脫色后，觀察并拍照留存。3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果.1. 沉默載體的構(gòu)建沉默載體 pCLCrVA 中所插入的目標(biāo)基因的大小會(huì)直接影響到目標(biāo)基因的沉默效率，如段過長(zhǎng)會(huì)妨礙病毒沉默載體在植物中的移動(dòng)，Burch-Smith 等（2004）通過研究報(bào)道，中的插入片段在 300bp 到 500bp 之間效果最好。在本研究中，目標(biāo)基因的片段均在這個(gè)圖 3-1 A）；目的片段連接中間載體后，通過雙酶切獲得了目的基因片段（圖 3-1 B）；的基因片段，連接載體后用菌落 PCR 篩選（圖 3-1 C），酶切驗(yàn)證 VIGS 載體（圖 3-1 D農(nóng)桿菌后，菌落 PCR 鑒定（圖 3-1 E）。A. B.

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第三章 VIGS 技術(shù)鑒定抗黃萎病相關(guān)基因1-4:GhFLS2(352 bp); 5-8: GhMRH1(342 bp); 9-12: GhAGD13(412 bp); 13-16: GhWRKY29(310 bp). B: Intermediate vector enzymedigestion M: 200 bp marker 1-3: GhFLS2; 4-6: GhAGD13; 7-9: GhMRH1; 10-12: GhWRKY29. C: Silent vector colony PCR M: 20bp marker 1-6: GhFLS2; 7-11: GhAGD13; 12-15: GhMRH1; 16-19: GhWRKY29. D: Silent vector enzyme digestion verification M: 20bp marker 1: GhFLS2; 2: GhMRH1; 3: GhAGD13; 4: GhWRKY29. E:Agrobacterium colony PCR M: 200 bp marker 1-4: GhMRH5-8: GhWRKY29; 9-14: GhAGD13; 15-21: GhFLS2.3.3.2. VIGS 技術(shù)沉默 GhCLAIGhCLAI 是棉花葉綠素合成過程中所需要的關(guān)鍵基因，缺少該基因棉株會(huì)出現(xiàn)白化癥狀。研究使用子葉注射的方法將 pCLCrVA-GhCLAI-pCLCrVB 注射接種棉株后，約 20 天左右該處的棉株新生葉片首先出現(xiàn)白化的現(xiàn)象，之后整個(gè)棉株逐漸白化，而野生型對(duì)照和接種空載pCLCrV（A+B）的棉株正常生長(zhǎng)且未曾出現(xiàn)白化現(xiàn)象，說明該病毒沉默載體 pCLCrV（A+B）以成功沉默掉目標(biāo)基因且對(duì)棉株的正常生長(zhǎng)無影響（圖 3-2）。

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3107008