核盤(pán)菌是一種重要的植物病原真菌,且寄主廣泛,由其引起的菌核病危害嚴(yán)重,目前缺乏高效、綠色的防治手段。真菌病毒是侵染真菌的病毒,能夠引起寄主致病力衰退的真菌病毒是潛在的生物防治資源。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已發(fā)現(xiàn)多種能夠引起核盤(pán)菌致病力衰退的病毒,DNA病毒SsHADV-1就是其中之一。SsHADV-1具有強(qiáng)侵染力,其病毒粒子可侵染核盤(pán)菌菌絲,擴(kuò)散受到寄主營(yíng)養(yǎng)體不親和性的影響小,具有良好的防治菌核病的前景。為了研究SsHADV-1病毒引起核盤(pán)菌致病力衰退的機(jī)制,我們運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)比較了攜帶SsHADV-1的菌株DT-8和不攜帶病毒的菌株DT-8VF在活體油菜葉片上基因表達(dá)的差異。收集DT-8和DT-8VF的菌絲片段懸液,分別接種在活體油菜植株的葉片上,置于20℃光照培養(yǎng)室保濕培養(yǎng)。在接種油菜6 hpi、12 hpi、18 hpi和24 hpi時(shí)收取菌絲提取總RNA,測(cè)序后得到各個(gè)樣本轉(zhuǎn)錄信息。比較不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)菌株DT-8中與菌株DT-8VF中基因的表達(dá)情況,在核盤(pán)菌接種油菜6 hpi時(shí),菌株DT-8中顯著上調(diào)基因816個(gè),顯著下調(diào)基因587個(gè);12 hpi時(shí)顯著上調(diào)基因795個(gè),顯著下調(diào)基因8... 

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菌核病的病害循環(huán)和發(fā)病癥狀（Boltonetal2006）

Reverse primers (10 μM) 0.5 μLDNA 模板cDNA：100 ng - 100 fgGenomic DNA：50 ng - 5 pg補(bǔ)去離子水至 20 μL反應(yīng)條件：95℃，30 s；95℃，5 s，60℃，30 s 重復(fù) 35-40 個(gè)循環(huán)；65℃-95℃，每個(gè)循環(huán)上升 0.5℃，持續(xù) 5 s。在 Bio-Rad CFX 96 儀器上進(jìn)行反應(yīng)。待擴(kuò)增結(jié)束后，使用 2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量（Livak & Schmittgen 2001）。3. 轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)結(jié)果和分析3.1 總 RNA 質(zhì)量檢測(cè)合格菌絲懸液接種活體油菜葉片后，噴水保濕于 20℃培養(yǎng)室培養(yǎng)，并分別取樣，取樣完成后油菜葉片發(fā)病情況見(jiàn)圖 2.1，可知菌株 DT-8VF 接種后的葉片在 18 h 出現(xiàn)水漬狀病斑，而接種菌株 DT-8 的葉片在 24 h 后也沒(méi)有出現(xiàn)明顯病斑。

圖 2.2 核盤(pán)菌菌株 DT-8 和 DT-8VF 的菌絲接種活體油菜葉片后菌絲總 RNA 樣品注：泳道 1-4 分別為核盤(pán)菌菌株 DT-8 和 DT-8VF 的菌絲片段接種活體油菜葉片 6 hpi、12 hpi、18 hpi 和 24hpi 時(shí)樣品總 RNA，DT-8VF-G1、DT-8VF-G2 和 DT-8VF-G3 為菌株 DT-8VF 的菌絲片段接種油菜后總 RNA 的 3組生物學(xué)重復(fù)，DT-8-G1、 DT-8-G2 和 DT-8-G3 為菌株 DT-8 的菌絲片段接種油菜后總 RNA 的 3 組生物學(xué)重復(fù)Fig.2.2 Electrophoretogram of total RNA of strain DT-8 and DT-8VF after inoculated on living B.napusLane 1 to 4 are total RNAs of strain DT-8 and DT-8VF after inoculating on living B. napus at 6 hpi, 12 hpi, 18 hpi and24 hpi; G1, G2 and G3 are three groups of biological replicates of RNA of strain DT-8 and DT-8VF at different timepoints after inoculated on B. napus對(duì) 24 個(gè)總 RNA 樣品反轉(zhuǎn)錄，設(shè)計(jì) SsHADV-1 引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，檢測(cè) DT-8VF樣品是否被病毒 SsHADV-1 污染。由圖 2.3 可知樣品 DT-8 中 DNA 病毒含量高，而DT-8VF 樣品中無(wú) DNA 病毒（DT-8VF-G1-2 和 DT-8VF-G2-2 中有 SsHADV-1 弱帶，推測(cè)是操作不當(dāng)導(dǎo)致的病毒污染）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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