飛蝗(Locusta migratoria)是重要的農(nóng)業(yè)害蟲,其胚胎期有多次表皮生成和降解,包括漿膜表皮形成與降解、胚胎第一層表皮形成與降解、胚胎第二層表皮形成與降解和胚胎第三層表皮形成。其中胚胎第二層表皮包裹飛蝗預若蟲,稱為預若蟲表皮,其合成和降解受阻引起飛蝗孵化受阻,是早期飛蝗防治的重要階段。本研究將通過對飛蝗預若蟲表皮超微結(jié)構(gòu)的動態(tài)觀察,明確預若蟲表皮結(jié)構(gòu)及其形成和降解規(guī)律;通過研究飛蝗幾丁質(zhì)合成酶LmCHS1和幾丁質(zhì)酶LmCht5-2在預若蟲階段的表達特性、表達定位和功能研究,解析其參與預若蟲表皮幾丁質(zhì)代謝的作用機制,為卵期害蟲防治提供新的靶標分子。1、飛蝗預若蟲表皮超微結(jié)構(gòu)及幾丁質(zhì)發(fā)育變化通過對30℃條件下9-14 d飛蝗胚胎超微結(jié)構(gòu)的動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),預若蟲表皮分為上表皮(Epicuticle)和原表皮(Procuticle);于第10 d時(E10H0)開始生成,出現(xiàn)上表皮;E11H0時形成完整的含有原表皮和上表皮的表皮結(jié)構(gòu)。降解步驟為:E12H0-E12H12上表皮和原表皮發(fā)生分離;E12H12-E13H0發(fā)生皮層溶離;E13H0-E14H0原表皮降解。熒光染料Fluorescent Brightener 28染色觀察發(fā)現(xiàn),預若蟲表皮幾丁質(zhì)在E11時沉積最厚,與超微結(jié)構(gòu)觀察一致。E12時,預若蟲表皮降解,幾丁質(zhì)變薄,并開始遠離胚胎,E13-E14時,預若蟲表皮幾丁質(zhì)逐漸降解。2.LmCHS1參與預若蟲表皮幾丁質(zhì)合成RT-qPCR檢測顯示LmCHS1基因在E9時表達升高,在E11時達到最高峰。免疫組化發(fā)現(xiàn),LmCHS1蛋白在表皮細胞質(zhì)中表達;在E11時表達量最高,且可分泌至表皮層中。顯微注射dsLmCHS1至E7飛蝗胚胎,發(fā)現(xiàn)RNAi可顯著降低預若蟲期LmCHS1的表達(約88%);造成飛蝗孵化受阻,致死率為50.6%。HE染色觀察顯示,dsLmCHS1組預若蟲表皮形成受阻。免疫組化顯示dsLmCHS1顯著抑制LmCHS1蛋白表達并降低預若蟲表皮幾丁質(zhì)的含量。超微結(jié)構(gòu)觀察顯示,dsLmCHS1組原表皮形成受阻,幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)消失。因此得出,LmCHS1對預若蟲表皮幾丁質(zhì)合成和原表皮形成具有重要作用,是飛蝗卵期防治的重要靶標。3.LmCht5-2參與預若蟲表皮幾丁質(zhì)降解幾丁質(zhì)酶5是參與昆蟲表皮降解的重要酶類。飛蝗幾丁質(zhì)酶5包含2個基因,LmCht5-1和LmCht5-2。前期研究發(fā)現(xiàn)沉默LmCht5-1引起預若蟲表皮原表皮降解受阻,孵化致死。本研究擬在此基礎上,解析LmCht5-2參與飛蝗預若蟲表皮降解的作用機制。RT-qPCR檢測顯示LmCht5-2基因E11時表達顯著性提高,且在E12時仍維持相對較高的表達量。免疫組化發(fā)現(xiàn),LmCht5-2蛋白在E12-E13具有較高表達量,可在表皮細胞和表皮層觀察到紅色熒光信號。通過顯微注射技術(shù)對E9飛蝗胚胎注射dsLmCht5-2,發(fā)現(xiàn)RNAi可顯著降低預若蟲期LmCht5-2的表達(約87.5%);并造成飛蝗孵化受阻,致死率為80%。超微結(jié)構(gòu)觀察顯示,干擾LmCht5-2影響飛蝗預若蟲表皮上表皮/原表皮分離和原表皮降解。綜上所述,飛蝗預若蟲表皮分為原表皮和上表皮兩部分,LmCHS1和LmCht5-2分別參與預若蟲表皮幾丁質(zhì)的形成和降解,是早期害蟲防治重要的分子靶標,本研究結(jié)果將為害蟲卵期防治分子靶標的研發(fā)和基于調(diào)控卵的蛻皮發(fā)育進行害蟲控制提供思路。
【學位單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S433.2
【部分圖文】：

圖 2.1 飛蝗預若蟲期表皮生成的超微結(jié)構(gòu)觀察Fig.2.1 Ultrastructure of the deposition of pro- nymph cuticle in L.migratoria注：Epi:上表皮 Epicuticle Pro:原表皮 Procuticle EC:表皮細胞 Epidermal cell 飛蝗預若蟲期表皮降解過程的超微結(jié)構(gòu)觀察通過對預若蟲表皮不同發(fā)育時期超微結(jié)構(gòu)進行動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，E11H0 預若蟲表

圖 2.2 飛蝗預若蟲期表皮的降解Fig.2.2 Degradation of pro- nymph cuticle in L.migratoria注：Epi:上表皮 Epicuticle Pro:原表皮 Procuticle EC:表皮細胞 Epidermal cell.3 飛蝗預若蟲期表皮幾丁質(zhì)形成研究對 30℃環(huán)境下正常發(fā)育的 9-14 d 飛蝗卵進行取樣，制備其橫向石蠟切片，觀

圖 2.3 飛蝗預若蟲表皮幾丁質(zhì)發(fā)育變化Fig.2.3 The chitin development of pro-nymph cuticle in L.migratoria注：藍色為幾丁質(zhì)信號；綠色為細胞核信號2.4 討論飛蝗是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，由于其繁殖能力和遷飛能力強，尚無有效的防治
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本文編號：2893309