磷酸化是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,在植物病毒侵染過程中發(fā)揮重要作用。病毒的復制酶、運動蛋白、外殼蛋白和病毒編碼的RNA沉默抑制子(viral suppressor of RNA silencing,VSR)被磷酸化后都可以調(diào)節(jié)病毒的侵染和致病性。大麥條紋花葉病毒(Barly striosaic virus,BSMV)是一種ss(+)RNA病毒,它編碼的γb蛋白在植物防御和病毒反防御的軍備競賽中具有多重功能,但γb蛋白是否存在磷酸化修飾及其對病毒侵染和寄主響應(yīng)的影響并不清楚。本研究分析了γb蛋白磷酸化的生物學功能,并對本生煙激酶STY46通過與γb蛋白互作負調(diào)控BSMV侵染的分子機制進行了初步分析。本研究首先利用絲氨酸磷酸化特異抗體(anti-phosphoserine)檢測到BSMVI γb蛋白在受侵染的植物體內(nèi)存在磷酸化修飾,經(jīng)體外磷酸化實驗和質(zhì)譜分析,證明γb蛋白可以被本生煙中類PKA蛋白激酶磷酸化,Ser-96是其主要的磷酸化位點。γb蛋白非磷酸化突變體病毒(BSMVS96A和BSMVS96R)誘導雙子葉植物和單子葉植物產(chǎn)生細胞壞死反應(yīng),病株中的病毒積累量減少,而模擬磷酸化突變體病毒BSMVS96D的致病癥狀與野生型病毒一致,說明γb的磷酸化狀態(tài)影響了 BSMV的致病性和病毒積累量。γb蛋白非磷酸化突變體S96A的VSR活性顯著減弱,而模擬磷酸化突變體S96D的VSR活性與野生型γb相當。γb蛋白的磷酸化狀態(tài)不影響其自身互作和多聚化能力,但磷酸化化后可增強其結(jié)合21 nt siRNA的能力。這些結(jié)果表明,γb蛋白被PKA磷酸化是其發(fā)揮VSR活性進而抑制寄主RNA沉默所必需的。除抑制植物RNA沉默外,γb蛋白被PKA磷酸化還能夠抑制寄主的細胞壞死反應(yīng)。利用瞬時表達、轉(zhuǎn)基因植株組成型表達和通過γb缺陷型病毒(BSMV△γb)侵染表達等實驗,證明來源于其它病毒的RNA沉默抑制子均不能抑制BSMVS96A引起的細胞壞死反應(yīng),只有回補正常功能的Yb蛋白才能有抑制作用。證明磷酸化的γb蛋白對植物細胞壞死反應(yīng)的抑制獨立于其VSR活性,這兩種抑制作用在功能上是相互獨立的。因此,γb在Ser-96被PKA磷酸化對于維持病毒持續(xù)侵染和寄主適度反應(yīng)的平衡至關(guān)重要。除此之外,還發(fā)現(xiàn)BSMV yb蛋白與本生煙激酶NbSTY46在體內(nèi)和體外直接互作,γb的BM結(jié)構(gòu)域(aa 19-47)和STY46激酶家族的保守氨基酸Thr-436分別是互作的關(guān)鍵區(qū)和關(guān)鍵氨基酸。NbSTY46的Thr-436突變?yōu)锳(T436A)后,不僅其自磷酸化活性喪失,而且既不能與γb互作也不能將γb磷酸化。BSMV侵染不影響NbSTY46表達水平,也不改變其亞細胞定位。瞬時表達和轉(zhuǎn)基因組成型超表達NbSYT46激酶均抑制病毒的侵染和復制,而通過轉(zhuǎn)基因下調(diào)本生煙NbSYT46的表達可加重BSMV的癥狀,增加病毒積累量,且NbSTY46對病毒侵染的負調(diào)節(jié)依賴其激酶活性。超表達NbSTY46不影響γb的VSR活性,但競爭性BiFC的初步結(jié)果暗示NbSTY46有可能抑制γb蛋白與復制酶αa的互作。上述研究結(jié)果表明,自磷酸化的本生煙激酶NbSYT46通過與γb直接互作并將其磷酸化負調(diào)節(jié)BSMV的復制,進而抑制BSMV的侵染。這些研究結(jié)果為闡明病毒蛋白磷酸化如何平衡病毒的持續(xù)侵染和寄主的適度反應(yīng),以及植物激酶蛋白在病毒與寄主互作中的防御功能提供了新的科學證據(jù)。
【學位單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S432.41
【部分圖文】：

圖１－１抗病毒ＲＮＡ沉默通路以及不同ＲＮＡ沉默抑制子發(fā)揮功能的機制（Ｃｒｏｒｂａｅｔａｌ．，?２０１５）??植物體內(nèi)主要包括兩種水平的基因沉默：轉(zhuǎn)錄水平上的基因沉默ＴＧＳ?（右）和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默ＰＴＧＳ?（左）。??其中ＲＮＡ病毒的ＶＳＲ主要抑制ＰＴＧＳ，?ＤＮＡ病毒主要抑制ＴＧＳ。紅色標注代表各個ＶＳＲｓ發(fā)揮功能的機制。??植物通過ＲＮＡ沉默途徑來抵抗病毒的侵染，為了抵抗植物的抗病毒ＲＮＡ沉默，病毒在長期??進化的過程中產(chǎn)生一類蛋白，稱之為病毒編碼的ＲＮＡ沉默抑制子（ｖｉｒａｌ?ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ?ｏｆ?ＲＮＡ??ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，?ＶＳＲ）。目前己報道的ＲＮＡ沉默抑制子有５０多種，幾乎涵蓋了所有的植物病毒屬??２??

圖１－２?ＴＣＶ?ＣＰ－ＨＲＴ介導的細胞壞死反應(yīng)模型（Ｚｈｕ?ｅｔａｌ．，?２０１４）??ＨＲＴ主要存在于質(zhì)膜上，隨著ＴＣＶ的侵染，ＨＲＴ可以識別ＣＰ蛋白，此時可以誘導大部分的ＤＲＢ４重新定位到細??胞質(zhì)中，與ＣＰ互作。ＫＤＳ１通過與ＨＲＴ互作增強ＨＲＴ－ＣＰ介導的細胞壞死反應(yīng)，ＣＲＴ１通過與ＨＲＴ互作維持其蛋??白穩(wěn)定性，但二者均不與ＴＣＶＣＰ互作，作者推測ＣＰ介導的ＨＲ反應(yīng)的激活可能與其減弱ＨＲＴ－ＤＲＢ４的互作相關(guān)。??（２）?ＰＶＸ?Ｐ２５蛋白引起的類ＨＲ?（ＨＲ－ｌｉｋｅ）壞死反應(yīng)??ＰＶＸ的基因組由一條正義單鏈ＲＮＡ組成，編碼三聯(lián)體運動蛋白（ｔｒｉｐｌｅ?ｇｅｎｅ?ｂｌｏｃｋ，?ＴＧＢ）。其??

旋實驗發(fā)現(xiàn)ｙｂ在體外確實可以促進ａａ將ｄｓＲＮＡ打開為ｓｓＲＮＡ，而且當丫ｂ喪失結(jié)合ｓｓＲＮＡ的能??力時，便不能促進ａａ的解旋能力（Ｚｈａｎｇ?ｅｔ?ａｌ．，２０１７）。通過以上結(jié)果，Ｚｈａｎｇ等人提出了?ｙｂ參與??ＢＳＭＶ復制的模型（圖１－４）：??妙?ｉｆ??ｎｄｓＲｉ?／?多、??１ｖ—?丨丨丨ＩＴ＿?丨?１１１（＋）??、?公／ｂ?＾ｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉ（．）??＾?▲?Ｙｂ?Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ?ｏｆ?ｙｂ??．?Ｙｂ?／?Ｉ??７?ＴｂＴｂ（＾ｊ丨丨丨ｉｌｌ丨丨丨ＩｉｉＩｉＩｉｉ川丨丨＂Ｉ川丨丨??（＋）ｇＲＮＡ?Ｖ?＼?％ｍｉｎｉｉｉｉｉｉｍｉｉｉｉｉｉｉｉ??Ｃｙ’ｎｄｉｎｇ??Ｔｒａｎｓ．ａｔ．ｃｎ?Ｖ??圖１－４?ＢＳＭＶｙｂ蛋白參與病毒復制的模型（Ｚｈａｎｇ?ｅｌ?ａｌ．，?２０１７）??在復制的初始階段，ｃｉａ和ｙａ蛋白從亞基因組翻譯出來并形成病毒復制復合物（ｖｉｒａｌ?ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ?ｃｏｍｐｌｅｘ，?ＶＲＣ）。ａａ??復制酶亞基與Ｙａ復制酶相互作用，定位于葉綠體。ＶＲＣ形成后，復制酶可以利用親本ｇＲＮＡ作為模板合成負鏈??ｇＲＮＡ，兩條鏈形成ｄｓＲＮＡ。首先，以ｄｓＲＮＡ為模板合成正鏈ＲＮＡ以利于ａａ和丫ａ復制酶亞基的翻譯，隨后，合??成負鏈ＲＮ／＾并且ａａ通過與７ｂ蛋白互作將其募集至葉綠體，通過增強ａａ解螺旋酶活性來促進病毒的復制。??１．１．３?ＶＳＲｓ與宿主蛋白的互作研究??植物通過抗病毒ＲＮＡ沉默途徑來防御病毒的侵染，病毒為了成功的侵染植物進化出ＲＮＡ沉??默抑制子
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本文編號：2887842