微孢子蟲(chóng)(Microsporidia)是一類(lèi)細(xì)胞內(nèi)專性寄生的真核生物,在自然界具有廣泛的宿主域,數(shù)目眾多、分布廣泛。家蠶微孢子蟲(chóng)(Nosema bombycis,Nb)是微孢子蟲(chóng)屬的典型種,它能夠引發(fā)家蠶微粒子病(Pebrine)。該病即可食下傳染,也可由帶病母蛾胚種傳染,是蠶業(yè)生產(chǎn)上的毀滅性病害,因此被所有蠶業(yè)生產(chǎn)國(guó)列為法定檢疫對(duì)象。除通過(guò)母蛾鏡檢淘汰帶毒蠶種外,目前家蠶微粒子病的防治方法還包括化學(xué)防治和物理防治兩大類(lèi)�；瘜W(xué)防治方法包括化學(xué)藥物消毒和化學(xué)藥物治療。消毒藥物一般具有強(qiáng)腐蝕性,而且對(duì)帶毒蠶卵中的病原體沒(méi)有防治效果;治療藥物長(zhǎng)期服用對(duì)蠶體有一定毒性,影響蠶種質(zhì)量。已報(bào)道的物理防治法主要有溫湯浴種法、高溫即時(shí)浸酸法(高溫即浸法)及干熱空氣處理法。高溫即浸法效果明顯,操作簡(jiǎn)單,但之前高溫即浸試驗(yàn)以多化性家蠶品種開(kāi)展的研究,針對(duì)二化性蠶品種的高溫即浸法條件尚未建立,防治效果有待驗(yàn)證。本研究通過(guò)養(yǎng)蠶試驗(yàn)明確了高溫高溫即浸法對(duì)家蠶微粒子病的防治效果,采用吉姆薩染色法觀察了蠶種即浸適期病原在蠶卵中的發(fā)育形態(tài),利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了高溫即浸處理對(duì)蠶卵中家蠶微孢子蟲(chóng)的滅活效果,通過(guò)高通量測(cè)序分析了高溫即浸處理后家蠶胚胎和病原的基因表達(dá)變化,闡明了高溫即浸防治家蠶微粒子病胚種傳染的機(jī)理,為生產(chǎn)上應(yīng)用高溫即浸防治家蠶微粒子病提供科學(xué)依據(jù)。取得以下研究成果:⒈對(duì)家蠶二化性四元雜交品種兩廣二號(hào)的帶毒蠶卵進(jìn)行高溫即浸處理,蠶卵孵化后分別飼養(yǎng)至3齡眠蠶和5齡起蠶用顯微鏡鏡檢Nb,發(fā)現(xiàn)與常規(guī)即浸處理相比,帶毒蠶卵經(jīng)高溫即浸處理后家蠶微孢子蟲(chóng)感染率分別為3.55±1.55%和13.10±5.90%,相對(duì)防治效果分別是92.30±2.95%和81.80±0.06%。由此可見(jiàn),高溫即浸處理能夠有效阻斷家蠶微粒子病的胚種垂直傳播,對(duì)家蠶微粒子病有顯著的治療效果。2.通過(guò)吉姆薩染色法對(duì)高溫浸酸時(shí)期(卵齡18~22 h)帶毒蠶卵中家蠶微孢子蟲(chóng)的發(fā)育狀態(tài)進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)帶毒蠶卵中的病原為雙核、四核裂殖體。浸酸處理48 h后,陽(yáng)性對(duì)照組和常規(guī)即浸處理組蠶卵中均仍觀察到裂殖體,高溫處理組則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病原,推測(cè)高溫即浸處理的作用有效靶點(diǎn)為家蠶微孢子蟲(chóng)的裂殖體階段。3.利用熒光定量PCR技術(shù)建立了以家蠶微管蛋白Tubulin為靶基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)卵齡24~240 h陽(yáng)性對(duì)照、常規(guī)即浸組和高溫即浸組內(nèi)帶毒蠶卵中微孢子蟲(chóng)進(jìn)行絕對(duì)定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):常規(guī)或高溫即浸處理后每日取樣蠶卵中家蠶微孢子蟲(chóng)的檢測(cè)值均顯著降低,高溫即浸組明顯低于常規(guī)即浸處理,表明兩種浸酸處理對(duì)蠶卵中的家蠶微孢子蟲(chóng)均有滅活作用,但是高溫處理的滅活效果更為顯著。根據(jù)即浸處理后帶毒蠶卵內(nèi)病原量的變化規(guī)律,推測(cè)高溫即浸處理能夠滅活蠶卵內(nèi)的病原裂殖體,少量未被滅活的成熟孢子則能夠繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育。4.對(duì)帶毒蠶卵分別進(jìn)行常規(guī)即浸處理和高溫即浸處理,利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)陽(yáng)性對(duì)照組、常規(guī)處理組和高溫處理組的蠶卵樣本進(jìn)行高通量測(cè)序,并對(duì)處理前后的差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行GO功能分析和KEGG pathway分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),常規(guī)處理后家蠶差異表達(dá)基因400個(gè),病原差異表達(dá)基因38個(gè),高溫處理組后家蠶差異表達(dá)基因1999個(gè),病原差異表達(dá)基因20個(gè)。高溫即浸處理后家蠶熱激蛋白等基因表達(dá)顯著上調(diào),病原差異表達(dá)基因數(shù)量較常規(guī)處理組明顯降低,推測(cè)高溫即浸處理能夠激發(fā)蠶卵免疫應(yīng)答增強(qiáng)對(duì)病原的抗性,同時(shí)影響家蠶微孢子蟲(chóng)的基礎(chǔ)代謝導(dǎo)致病原裂殖體死亡。
【學(xué)位單位】：重慶師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：S884.21
【部分圖文】：

圖 1.1 家蠶微孢子蟲(chóng)的超微結(jié)構(gòu)[20]。Fig1.1 Ultrastructure of Nb的微孢子蟲(chóng)被蟻蠶或幼蟲(chóng)誤食后進(jìn)入蠶的消化道后，器和孢子形成期 3 個(gè)階段后，完成一個(gè)世代，這一過(guò)程

蟲(chóng)生活史示意圖[21-22]。L.中腸腸腔；MV 微絨毛肉細(xì)胞；H.血細(xì)胞；a.長(zhǎng)極絲孢子；b.發(fā)芽中的長(zhǎng)殖體；g.母孢子；h.孢子母細(xì)胞；n.長(zhǎng)極絲孢子母孢子；j.短極絲孢子；k.發(fā)芽中的短極絲孢子；m.

在卵齡分別為 18、20、22h的陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照蠶卵樣本中，陽(yáng)性對(duì)照組均觀察到微孢子蟲(chóng)的裂殖體，有雙核、四核裂殖體形態(tài)（黑色箭頭所指），表明沒(méi)有經(jīng)過(guò)處理的帶毒蠶卵中微孢子蟲(chóng)的增殖活動(dòng)旺盛（圖3.1），紅色箭頭所指為家蠶宿主細(xì)胞核結(jié)構(gòu)。圖 3.1 不同卵齡蠶卵中家蠶微孢子蟲(chóng)發(fā)育觀察。A 陽(yáng)性對(duì)照組，B 陰性對(duì)照組。Fig 3.1 The development observation of Nb in silkworm eggs of different age. A positive control, Bnegative control.3.2.3 作用靶點(diǎn)的驗(yàn)證卵齡 20h時(shí)分別進(jìn)行常規(guī)和高溫即浸處理，對(duì)浸酸處理后 48h的蠶卵進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在常規(guī)即浸處理中也可發(fā)現(xiàn)少量病原裂殖體，同期經(jīng)過(guò)高溫即浸處理后的蠶卵未發(fā)現(xiàn)病原（圖3.2），表明高溫即浸處理對(duì)微孢子蟲(chóng)的裂殖體有較好的滅活效果。
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本文編號(hào)：2887811