超低溫保存被認(rèn)為是目前最理想的植物種質(zhì)資源長期保存的方法。在諸多研究中發(fā)現(xiàn),不同實驗室用同樣的方法保存同一基因型時再生率有很大差異。探明導(dǎo)致這種情況發(fā)生的原因無疑將有利于不同實驗室超低溫基因庫的建立。病毒病害是制約蘋果生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的主要因素之一,無毒苗的培育是生產(chǎn)上防止病毒病害的核心技術(shù)。蘋果莖痘病毒(apple stem grooving virus,ASGV)是一種難以脫除的病毒,建立該病毒的高效脫毒新技術(shù)有利于蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。帶毒材料是病毒基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的前提條件。病毒是專性病原體,必須依賴寄主才能復(fù)制與增殖。因此,病毒的長期保存十分困難。建立病毒高效、安全、長期的保存技術(shù)可為病毒的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究提供病原材料。本研究旨在:(1)比較蘋果帶毒(ASGV)莖尖與無毒莖尖超低溫保存后再生的差異,并探討病毒導(dǎo)致莖尖超低溫保存后再生力低的原因;(2)建立熱處理結(jié)合莖尖超低溫療法高效脫除ASGV的技術(shù),并揭示其脫毒機理;(3)建立莖尖超低溫保存ASGV的技術(shù),并證明該技術(shù)保存病毒的有效性。本研究獲得的主要研究成果如下:1.以蘋果‘Gala’單感ASGV和無毒試管苗為試材,用小滴玻璃化(droplet-vitrification)保存莖尖。結(jié)果表明,帶毒莖尖與無毒莖尖的成活率和再生率均沒有明顯差異。但無毒莖尖的再生速度快于帶毒莖尖,且均再生正常的莖。帶毒莖尖表現(xiàn)出三種再生類型:正常莖、蓮座莖和蓮座莖帶不正常葉片,三種再生類型的比例分別為45%,32%和23%。ASGV帶毒苗和無毒苗在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后,帶毒苗形成的莖數(shù)/株為7.2,明顯高于無毒苗(5.1)。無毒苗形成的≥1.0 cm和1.0 cm但≥0.5 cm的莖數(shù)為2.9和2.2,且沒有0.5 cm的莖。帶毒苗形成的≥1.0 cm、1.0 cm但≥0.5cm和0.5 cm的莖數(shù)分別為1.8、2.8和2.6,分別占總莖數(shù)的25%、38.9%和36.1%。無毒苗的生長素(IAA)和玉米素(ZR)含量分別為15.9和14.3μg/g,明顯高于帶毒苗(12.4μg/g和11.2μg/g)。帶毒苗的可溶性糖、可溶性總蛋白和脯氨酸水平分別為11.1 mg/g、8.7 mg/g和17.2μg/g,分別比無毒苗高16%、30%和28%。無毒苗的電解質(zhì)滲出率為8.1%,明顯低于帶毒苗(9.8%)。組織切片對超低溫保存后成活細胞在莖尖的分布結(jié)果表明:無毒莖尖的成活細胞分布在頂端分生組織1-8層和第1-4葉原基,成活細胞的比例分別為62%和34%。而帶毒莖尖的成活細胞分布在頂端分生組織1-5層和第1-4葉原基,成活比例分別為46%和30%。細胞超微結(jié)構(gòu)研究表明:無毒莖尖和帶毒莖尖的超微結(jié)構(gòu)大致相似,唯有線粒體形態(tài)有所不同:無毒莖尖細胞的線粒體為卵形(正常),而帶毒莖尖細胞的線粒體明顯加長。帶毒試管苗生長素和玉米素的降低可能導(dǎo)致試管苗莖數(shù)量的增加和長度降低。病毒引起的細胞膜傷害(電解質(zhì)滲出率上升)和線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化可能降低細胞對超低溫的抗性,進而導(dǎo)致再生正常莖的能力降低。2.以單感ASGV的蘋果‘Gala’試管苗為試材,成功建立了熱處理結(jié)合小滴玻璃化法莖尖超低溫療法脫除ASGV的技術(shù)。將帶毒試管苗置于36 ~o C/32 ~o C(白天/夜間)光照條件下熱處理4周,從熱處理后的試管苗上取1.5 mm(帶3-4葉原基)的莖尖,經(jīng)小滴玻璃化超低溫處理或莖尖培養(yǎng),獲得再生試管苗。待試管苗移入溫室生長10個月后,用RT-PCR檢查植株的帶毒情況。結(jié)果表明,熱處理不會影響帶毒試管苗的成活,但明顯影響試管苗的營養(yǎng)生長:熱處理后植株莖的長度為2.5 cm,顯著低于對照(3.5 cm);但增殖率(4.7)明顯高于對照(2.5)。超低溫療法后的莖尖再生率隨熱處理周數(shù)的延長而明顯下降,但脫毒率明顯上升。熱處理4周的脫毒率為100%。熱處理后莖尖培養(yǎng)的再生率(78%)高于超低溫療法(44%),但前者的脫毒率(26%)明顯低于后者(100%)。熱處理結(jié)合莖尖超低溫療法分別得到了100%(‘Fuji’)、40%(‘濃果25’)、30%(‘瑞雪’)和83%(‘M9’)的脫毒率。免疫組織化學(xué)法對ASGV在‘Gala’和‘瑞雪’莖尖的定位表明:ASGV可感染兩個蘋果品種的頂端分生組織和幼嫩葉原基。隨著熱處理周數(shù)的增加,莖尖頂端分生組織的無毒區(qū)明顯擴大。熱處理4周后,‘Gala’莖尖的分生組織和第1-5片葉原基不能定位到病毒,而‘瑞雪’莖尖的第4葉原基中能明顯定位到病毒。超低溫療法處理后,‘Gala’和‘瑞雪’的莖尖頂端分生組織和第1-3片葉原基中有大量細胞成活,但‘Gala’在第4葉原基中僅有少量細胞成活,而‘瑞雪’的第四片葉原基中有較多細胞成活。病毒在不同基因型莖尖中分布的不同和超低溫處理后的莖尖細胞成活模式的差異解釋了不同基因型中存在脫毒率差異的原因。3,以單感ASGV的蘋果‘Gala’試管苗為試材,用小滴玻璃化法(droplet-vitrification)和包埋干燥法(encapsulation-dehydration)分別處理莖尖,獲得62-67%的再生率。再生試管苗經(jīng)RT-PCR檢測,兩種莖尖超低溫方法所獲得的再生苗ASGV帶毒率均為100%。與帶毒試管苗(對照)比較,超低溫保存后帶毒苗繼代培養(yǎng)8周后的增殖率和病毒濃度明顯低于對照,但繼代培養(yǎng)16周后的增殖與病毒濃度與對照相似。使用試管苗微型嫁接技術(shù)將超低溫保存后的帶毒苗嫁接在蘋果‘Gala’無毒試管苗上,嫁接21天后的傳毒率為100%。將超低溫保存后的病毒使用摩擦接種技術(shù)侵染煙草葉片,接種21天后,明顯觀察到煙草葉片上的病毒癥狀。應(yīng)用RT-PCR法在顯示癥狀的葉片中檢測到了病毒。對超低溫保存的ASGV病毒的三個基因片段(包括編碼外殼蛋白和運動蛋白)的測序結(jié)果表明,超低溫保存后的ASGV與對照ASGV基因序列的相似性為99.87%。本研究獲得的結(jié)果為使用無毒材料超低溫保存植物種質(zhì)資源提供了理論依據(jù)。熱處理結(jié)合莖尖超低溫療法為脫除難脫除的植物病毒提供了新的技術(shù)。莖尖超低溫病毒保存技術(shù)為植物病毒的安全、長期、高效保存開辟了新的途徑。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S436.611.1
【部分圖文】：

圖 1-1 本研究中的技術(shù)路線圖Figure 1-1 Research technique route of this study在 ASGV 感染影響蘋果試管苗莖尖超低溫保存的研究中對無毒和感染 ASGV 的苗‘Gala’莖尖超低溫保存后莖尖的再生以及試管苗的營養(yǎng)生長情況進行研究研究中獲得的差異，采用組織學(xué)觀察對超低溫保存后莖尖中的細胞成活情況進行，并對試管苗莖尖的細胞超微結(jié)構(gòu)進行觀察，此外還對試管苗的內(nèi)源激素水平和代謝物進行測定。在熱處理結(jié)合超低溫冷凍脫除 ASGV 病毒的研究中使用感染 ASGV 的‘Gala’苗為材料對脫毒體系中不同的熱處理時間和所取的莖尖大小進行優(yōu)化，將優(yōu)化好毒體系應(yīng)用在其它 4 個蘋果基因型中進行廣譜性測定。最后選用兩種再生率和脫差異較大的基因型，使用免疫組織化學(xué)病毒定位和組織學(xué)細胞染色的手段對不同熱處理后的莖尖病毒分布情況和冷凍后的細胞成活情況進行觀察，從而揭示獲得脫毒結(jié)果的機理。

的第二層和第五層成活細胞進行觀察。數(shù)據(jù)分析管苗營養(yǎng)生長和冷凍保存后的再生情況的研究采用包含 10 個樣本，每次試驗包含 3 個重復(fù)，所有試驗標(biāo)測定試驗中，每個指標(biāo)測定選取 5 個生物學(xué)重復(fù)保存后的組織成活研究，每個處理選取 30 個芽進行生組織細胞的超微結(jié)構(gòu)研究，每個處理選取 10 個芽析結(jié)合 Student’s t-test 在 P<0.05 檢驗來驗證其差異均值表示。株內(nèi)的檢測R 檢測，嫁接傳毒后的無毒材料中檢測出了 524 bp 擴增出任何 PCR 條帶。ASGV 的帶毒苗莖尖經(jīng)超低否正常，3 個月后都可在再生植株中檢出 ASGV 病

西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文.3.2 ASGV 感染對于超低溫保存后的蘋果莖尖的再生影響ASGV 感染的蘋果莖尖超低溫保存成活率與無毒植株莖尖超低溫保存后的成活相似，但無毒的莖尖經(jīng)冷凍保存后的再生速度明顯快于帶毒莖尖（圖 2-2c,d）。無莖尖超低溫保存結(jié)束后在 1 個月的時間內(nèi)可以完成再生。經(jīng)過 8 周再生后，超低溫存的無毒與帶毒莖尖的再生率沒有顯著性差異，但無毒苗的莖尖在再生過程中始終持正常的形態(tài)并可以進行后續(xù)的繼代擴繁（圖 2-2e，表 2-3）。然而，感染 ASGV毒的試管苗在再生過程中只有 45%表現(xiàn)正常形態(tài)，其余的占 32%的莖尖在再生過程表現(xiàn)蓮座狀帶正常葉片的形態(tài)（圖 2-2f，表 2-3）此外還有 23%的莖尖再生過程中現(xiàn)蓮座狀再生帶不正常形態(tài)的葉片 (圖 2-2g，表 2-3)。不正常的再生的莖尖無法在續(xù)繼代過程中正常的增殖。
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