發(fā)布時間：2020-11-03 00:41

　　 地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)W10是從植物根際篩選獲得的一株生防細菌,能較好地抑制多種植物病原真菌,田間防治效果明顯。該菌生防機制主要是產(chǎn)生一種抗菌蛋白。為了進一步了解該菌生防機制和進行應(yīng)用,本文對W10抗菌蛋白進行了純化鑒定、編碼基因克隆和蛋白表達分析,同時為了提高生防效果,本文還初步研究了其與水稻白葉枯病菌harpin蛋白Hpa1x∞的協(xié)同抗病作用,進而了解兩類不同信號通路蛋白互作的分子機制,為這兩類蛋白的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。利用硫酸銨沉淀和透析袋透析,從地衣芽孢桿菌W10培養(yǎng)上清濾液中獲得抗菌粗蛋白,經(jīng)AKTApurifier(HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 High Resolution)進一步純化,再將純化的抗菌蛋白通過5800超高分辨飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF/MS-MS)進行質(zhì)譜分析,根據(jù)Mascot搜索串級質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定為絲氨酸蛋白酶,并據(jù)此設(shè)計引物從W10基因組中獲得全長序列,經(jīng)測序含有1個ORF,編碼基因1347 bp。經(jīng)生物信息學(xué)分析,該基因編碼448個氨基酸殘基,分子量為48794.16 Da,等電點為6.04,是一種親水性蛋白,在二級和三級結(jié)構(gòu)中,a-螺旋和β-折疊所占比例相似,含有Peptidase_S8的保守結(jié)構(gòu)域。通過載體構(gòu)建,本文對W10抗菌蛋白編碼基因進行了克隆,并在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌系統(tǒng)中進行了表達。其中,在大腸桿菌系統(tǒng)中未能成功表達,在枯草芽孢桿菌系統(tǒng)中成功表達,但是表達出的蛋白分子量與上述有點誤差,且不具有抗菌活性,初步認為是在表達時氨基酸結(jié)構(gòu)可能有所改變,從而影響了分子量與抗菌活性。同時絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF對提取的抗菌蛋白有一定的抑制作用,進一步說明W10抗菌蛋白具有絲氨酸蛋白酶活性。此外,本文還研究了地衣芽孢桿菌W10抗菌蛋白與Hpa1x蛋白的協(xié)同抗病作用。兩種蛋白混合處理與各自單獨處理相比,能顯著增加對番茄灰霉病的防治效果;防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因檢測發(fā)現(xiàn),在三生煙中,W10抗菌蛋白誘導(dǎo)了hsr203J、COI1、Ntexp2、Ntexp6基因不同程度的表達,分別涉及HR、茉莉酸信號通路以及植物生長調(diào)節(jié)基因,Hpa1x∞蛋白誘導(dǎo)了hsr203J、aoxl、Ntexp2、Ntexp6基因不同程度的表達,涉及HR、活性氧代謝及植物生長調(diào)節(jié)基因。W10抗菌蛋白與Hpa1x∞蛋白混合處理則在三生煙中誘導(dǎo)了上述所有基因不同程度的表達,且表達強度比單獨處理有所增加。另外發(fā)現(xiàn),W10抗菌蛋白在轉(zhuǎn)hpalx∞基因煙草中能誘導(dǎo)hsr203J、Ntexp2、NtexC6、COI1、Chia5基因不同程度的表達。因此,這兩類蛋白在混合應(yīng)用時具有協(xié)同作用,通過增加相關(guān)信號通路和相關(guān)基因表達來提高對病害的防治作用。這將為整合生防資源提高生防效果,為開辟地衣芽孢桿菌W10的新的應(yīng)用途徑提供理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S476
【部分圖文】：

植物通過感應(yīng)病原菌的以ｃ基因調(diào)控信號，與經(jīng)過ＩＩＩ型分泌系統(tǒng)分泌的病原菌效應(yīng)蛋白??（ｅｆｆｅｃｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎｓ）（主要是Ａｖｒ蛋白）結(jié)合，隨后開啟級聯(lián)信號系統(tǒng)，使受侵染植物產(chǎn)??生防御反應(yīng)，促使表達防衛(wèi)基因，最終呈現(xiàn)抗性（圖１）【６８］。第二部分為如ａ（ｈｒｐａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）??基因，此類基因不是植物病原細菌與植物互作過程中所必需的，它只是有助于寄主致病性??或非寄主上誘導(dǎo)過敏性反應(yīng)。第三部分是一些非保守的ｋｐ基因［６９－ＴＯ］。??

利用ＤＮＡｍａｎ分析本蛋白的序列后選取了?Ａ７ｗ?Ｉ和ＡｃｏＪ？?Ｉ雙酶切位點，本蛋白基因片??段用說〇?Ｉ和雙酶切后回收產(chǎn)物，連接至孫〇?Ｉ和及〇及１雙酶切過的表達載體??ｐＥＴ－２８ａ（＋）上，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)基因載體ｐＥＴ－２８ａ（＋）：ｎｖ川（圖２）。??Ｘｂｏｌ??／?ＥｃｏＲｌ??＜?ｐＥＴ－２８ａ（＋）?Ｉ??ｖｙ??圖２重組質(zhì)粒ｐＥＴ－２８ａ（＋）：：ｗｌＯ示意圖??９．１．２引物設(shè)計及ＰＣＲ擴增??根據(jù)Ｗ１０抗菌蛋白基因序列，設(shè)計５’端分別帶有恐〇?Ｉ和及＂Ｏｉ？?Ｉ酶切位點的引物，進??行ＰＣＲ擴增。??引物如下：ｕｐ：?５，－ａｇｇａａｔｔｇＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧ－３，?（ＥｃｏＲｌ）?，?ｄｏｗｎ：??５５－ＡＴＡｃｔｃｇａｇＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＣＴＴＴＣＧＧＣＡＣ－３５?（恐〇?Ｉ?），５，三個堿基為保護性堿基，??紅色字體的為酶切位點，含下劃線的為起始密碼子和終止密碼子。ＰＣＲ反應(yīng)體系與反應(yīng)條??件如７．３。??ＰＣＲ產(chǎn)物按照７．２方法進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，按照９．１．３方法進行純化？??

１．１粗蛋白的提取及活性檢測??采用硫酸銨法從地衣芽孢桿菌Ｗ１０培養(yǎng)濾液中提取獲得了?Ｗ１０粗蛋白，平板抑菌實??驗表明（圖４），Ｗ１０粗蛋白可明顯抑制番茄灰霉病菌的生長。Ｗ１０粗蛋白經(jīng)過凍干濃縮??后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳顯示提取的粗蛋白含有兩種大小不同的蛋白物質(zhì)，大小分別接近４４．３??ｋＤａ及２０．１?ｋＤａ?Ｍａｒｋｅｒ條帶（圖５），其中４４．３?ｋＤａ大小的蛋白條帶與之前報道的抗菌蛋??白大小相似，因此可進行下一步蛋白純化工作。??．０，??圖４?Ｗ１０粗蛋白對番茄灰霉病菌的拮抗效果圖?圖５?Ｗ１０粗蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳圖??左為清水對照，右為粗蛋白?Ｍ：?Ｐｒｅｍｉｘｅｄ?Ｐｒｏｔｅｉｎ?Ｍａｒｋｅｒ?（Ｌｏｗ）；?１：?Ｗ１０粗蛋白??１．２粗蛋白的純化及活性檢測??采用ＡＫＴＡ低壓層析系統(tǒng)對提取的Ｗ１０粗蛋白進行純化，結(jié)果如圖６，出現(xiàn)３個洗脫??山簞，其中峰Ｉ的面積較大。收集各洗脫峰的洗脫液，經(jīng)過凍干濃縮后分別進行ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ??電泳
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 史毅;�？e;馬暉玲;;利用RNA-seq分析誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗性(ISR)產(chǎn)生時匍匐翦股穎轉(zhuǎn)錄因子的表達變化[J];草原與草坪;2018年01期

2 王超;郭堅華;席運官;田偉;;拮抗細菌在植物病害生物防治中應(yīng)用的研究進展[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2017年18期

3 盧幸蓉;陳大為;張樹武;劉佳;徐秉良;;黃瓜白粉病菌拮抗真菌鑒定及生防效果評價[J];中國生物防治學(xué)報;2017年03期

4 張旭輝;張紅楠;李勇;汪文強;;抑制西瓜蔓枯病菌的生防真菌篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J];中國生物工程雜志;2017年05期

5 王曉丹;雷安亮;王婧;班世棟;邱樹毅;;產(chǎn)四甲基吡嗪地衣芽孢桿菌的應(yīng)用[J];中國釀造;2017年02期

6 陳麗麗;何玲玲;趙雅;許婧云;紀兆林;童蘊慧;徐敬友;;地衣芽孢桿菌W10對煙草的促生作用及機制[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2016年05期

7 逯昀;常虹;閆振領(lǐng);;70億個/毫升地衣芽孢桿菌水劑對設(shè)施黃瓜枯萎病防治效果研究[J];商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報;2016年02期

8 王春曉;胡永紅;楊文革;吳剛;顧鵬飛;丁志雯;陳召國;;地衣芽孢桿菌NJWGYH 833051的抑菌作用[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2016年04期

9 令利軍;馮蕾;雷蕾;何楠;丁蘭;;地衣芽孢桿菌TG116誘導(dǎo)黃瓜抗病性相關(guān)防御酶系的研究[J];西北師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2016年01期

10 唐娜;陶樹興;梁健;馮曉磊;戶引紅;許真珍;熊平;;產(chǎn)絲氨酸蛋白酶芽胞桿菌的鑒定及其生防作用[J];陜西師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2016年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 初源;絲氨酸蛋白酶SP1、SP13、SP105在亞洲玉米螟天然免疫反應(yīng)中的功能及作用機制[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 程古月;高溫放線菌CDF芽胞表面蛋白酶及胞外絲氨酸蛋白酶的性質(zhì)和功能研究[D];武漢大學(xué);2010年

3 湯承;HarpinEcc蛋白對園藝植物的生物學(xué)效應(yīng)及其誘導(dǎo)抗性的分子機制解析[D];西南大學(xué);2006年

4 彭建令;兩類激發(fā)子（harpins和核黃素）啟動植物抗病防衛(wèi)和生長信號傳導(dǎo)的分子遺傳學(xué)解析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 胡俊;拮抗性芽孢桿菌的篩選及其抗菌肽的分離和性質(zhì)分析[D];安徽工程大學(xué);2017年

2 溫晨陽;馬鈴薯黃萎病生防木霉菌的篩選及防治技術(shù)研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

3 張旭輝;生防煙管菌的分離鑒定、條件優(yōu)化及其作用機制研究[D];西南大學(xué);2017年

4 馬俊飛;一株地衣芽孢桿菌對斷奶雌性仔豬玉米赤霉烯酮中毒癥的緩解作用[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

5 馮蕾;內(nèi)生地衣芽孢桿菌TG116誘導(dǎo)番茄對灰霉病系統(tǒng)抗性的初探[D];西北師范大學(xué);2016年

6 姜雪;酸性絲氨酸蛋白酶抗白血病細胞作用機制的研究[D];吉林大學(xué);2014年

7 歐秀玲;新疆小擬南芥NPR1基因的表達對植物系統(tǒng)抗病信號途徑影響的初步探究[D];石河子大學(xué);2013年

8 金雪菲;丁香假單胞菌Harpin蛋白誘導(dǎo)煙草抗野火病活性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

9 李琳;Harpin(X_(oo))和Harpin_X_m蛋白激發(fā)煙草氧爆發(fā)相關(guān)基因的時序性表達及其納米粒的制備[D];海南大學(xué);2012年

10 Olivia Sakhile Juba;球毛殼菌絲氨酸蛋白酶基因克隆及原核表達研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2010年

本文編號：2867826