楊樹(Populus)是我國北方重要的造林樹種,具有很高的經(jīng)濟和生態(tài)價值,但是其對水分缺乏和病原菌侵染敏感的特點嚴重限制了其生長與楊樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。探索楊樹對病害和干旱脅迫的響應(yīng)機制并鑒定關(guān)鍵調(diào)控基因,對通過基因工程技術(shù)快速培育抗逆性提高的楊樹新品種具有重要的理論意義與應(yīng)用前景。本論文在實驗室前期對楊樹干旱RNA-seq生物信息分析的基礎(chǔ)上,以響應(yīng)干旱脅迫并上調(diào)表達的microRNA472和楊樹特異的microRNA6445為研究對象,通過在84K楊(P.alba ×P.glandulosa).中分別過表達或沉默miR472a和楊樹特異的miR6445后,探索其在應(yīng)對干旱脅迫和病原菌侵染中的功能,為基因工程改良楊樹抗逆性提供了基因資源與理論依據(jù)。具體研究內(nèi)容如下:1.為了研究miR472a在植物抗病與抗旱中的作用,本論文構(gòu)建miR472a的過表達以及沉默載體,并利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法在84K楊中進行過表達和沉默miR472a,得到過表達株系miR472aOE(株系)和沉默株系STTM472a(株系)。本文分別用降解組數(shù)據(jù)、5'RACE、煙草共表達三種方法驗證了NBL1為miR472a的靶基因。同時熒光定量PCR顯示NBL1、NBL2、NBL3和NBL4在miR472aOE株系中下調(diào)表達,在STTM472a株系中上調(diào)表達,該結(jié)果也驗證了它們受miR472a靶向。另外,我們通過熒光定量 PCR 發(fā)現(xiàn)了 miR472 觸發(fā) phasiRNAs(SIR14、SIR16、SIR17、SIR21和SIR25)的產(chǎn)生。產(chǎn)生的phasiRNAs(如SIR16、SIR21和SIR25等)又靶向調(diào)控其他NBS-LRR(如NBL2等)基因,從而使NBS-LRR在正常生長條件下處于極低的表達水平。2.論文對野生型、過表達株系miR472aOE和沉默株系STTM472a分別進行flg22、半活體寄生真菌膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和腐生真菌金黃殼囊孢菌(Cytospora chrysosperma)的處理,結(jié)果顯示:在flg22處理后,miR472aOE株系的H2O2進發(fā)和胼胝質(zhì)堆積明顯低于野生型和STTM472a株系;在C.gloeosporioides處理后,野生型葉片中miR472a的表達量減少而NBL1-NBL4的表達量升高,miR472aOE株系的病斑面積明顯大于野生型和STTM472a株系;在C chrysosperma處理后,miR472aOE株系具有最小的病斑面積,JA/ET信號通路中的標記基因ERF1基因最早在miR472aOE株系中出現(xiàn)上調(diào)表達。以上結(jié)果表明miR472a負調(diào)控了flg22和C.gloeosporioides觸發(fā)的免疫反應(yīng),而增強了植物對于C chrysosperma的抗性。3.對胡楊進行干旱處理后發(fā)現(xiàn),miR472a在葉片(尤其是幼葉)中上調(diào)表達,而在根中下調(diào)表達。為了探究miR472a在植物響應(yīng)干旱脅迫中的角色,論文在不同的轉(zhuǎn)基因楊樹株系中進行了干旱處理,發(fā)現(xiàn)miR472aOE株系在干旱處理第4天出現(xiàn)萎蔫,而STTM472a株系和野生型在第六天才表現(xiàn)出萎蔫現(xiàn)象,這表明miR472負調(diào)控了楊樹的干旱脅迫響應(yīng)。而在正常生長條件下,miR472aOE株系比野生型和沉默株系表現(xiàn)出更大的葉面積和生物量,這表明miR472a正向調(diào)控了楊樹的生長發(fā)育。為了探究NBS-LRR基因是否參與了楊樹的干旱脅迫響應(yīng),我們選擇NBL1與NBL2在擬南芥中的同源基因突變體nbl1和nbl2來進行甘露醇處理下的萌發(fā)率實驗,結(jié)果表明在正常和甘露醇處理條件下這兩個突變體的萌發(fā)率與野生型之間均無明顯差異。我們發(fā)現(xiàn)一個預(yù)測的miR472a靶基因FB1(F-box)基因在過表達株系中下調(diào)而在沉默株系中上調(diào)表達,之后通過共轉(zhuǎn)煙草實驗證明其為miR472a的靶基因。在甘露醇處理下,FB1在擬南芥中的同源基因突變體fb1種子萌發(fā)率和根長增長量明顯低于野生型,在自然干旱條件下,fb1突變體更快出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象,這說明FB1正向調(diào)控了植物干旱脅迫響應(yīng)。而在正常條件下,突變體fb1具有更大的根長增長量、葉面積和生物量,這表明FB1可能負調(diào)控了生長發(fā)育�？傊�,miR472a可能通過靶向FB1正調(diào)控植物的生長發(fā)育而負調(diào)控干旱脅迫響應(yīng)。4、為了研究楊樹特異的miR6445在植物抗病與抗旱中的作用,本文分析了MIR6445b的啟動子序列,發(fā)現(xiàn)在其啟動子區(qū)存在MBS、CGTCA和TGACG-motif等與干旱脅迫和茉莉酸信號相關(guān)的順式作用元件。此后,構(gòu)建了 miR6445的沉默表達載體,在楊樹中沉默miR6445得到轉(zhuǎn)基因沉默株系STTM6445。熒光定量結(jié)果表明,miR6445可能的靶基因NAC112、NAC097、NAC152、NAC088在沉默株系STTM6445中表達量上調(diào)。對野生型和STTM6445株系進行干旱處理后發(fā)現(xiàn),STTM6445株系在干旱第四天出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象,而野生型在第六天才開始出現(xiàn)萎蔫,STTM6445株系在干旱處理后的相對電導率明顯高于野生型。之后,對野生型和STTM6445株系進行腐爛病菌處理實驗發(fā)現(xiàn),STTM6445株系在腐爛病菌處理后有更大的病斑面積,這表明miR6445可能正調(diào)控了植物的耐旱性和腐爛病抗性。綜上,miR472a通過靶向NBS-LRR基因以及觸發(fā)phasiRNAs負調(diào)控楊樹對膠孢炭疽菌的免疫反應(yīng),而增強植物對金黃殼囊孢菌的抗性;miR472a通過靶向F-box基因FB1負調(diào)控植物的干旱脅迫響應(yīng)信號,而促進植物的生長發(fā)育。miR6445可能通過靶向NAC轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)控了楊樹抗旱性和對腐爛病菌的抗性。本研究為植物抗旱和抗病育種提供了基因資源和理論基礎(chǔ)。
【學位單位】：北京林業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S763.7
【部分圖文】：

ＮＢＳ－ＬＲＲ蛋白是一類己知的最大的Ｒ蛋白家族，植物中的ＮＢＳ－ＬＲＲ屬于ＡＡＡ＋??超家族的?ＳＴＡＮＤ?（ｓｉｇｎａｌ－ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ?ＡＴＰａｓｅｓ?ｗｉｔｈ?ｎｕｍｅｒｏｕｓ?ｄｏｍａｉｎｓ）?Ｐ－ｌｏｏｐＡＴＰ?酶??（Ｂｏｎａｒｄｉ?ｅｔ?ａｌ．，２０１１）。典型的ＮＢ－ＬＲＲ類蛋白能夠直接或間接的識別病原菌的效應(yīng)因??子來激活免疫反應(yīng)。這些蛋白包含一個核苷酸結(jié)合位點和富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域，中心??的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域是控制ＡＴＰ／ＡＤＰ結(jié)合狀態(tài)調(diào)控下游信號的分子開關(guān)（Ｔａｋｋｅｎ?ｅｔ??ａｌ．，２００９）。Ｎ?端的?ＣＣ?（ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ）或?ＴＩＲ?（Ｔｏｌｌ／Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－ｌ?ｒｅｃｅｐｔｏｒ）結(jié)構(gòu)域被認??為是信號識別結(jié)構(gòu)域，它們能夠與效應(yīng)因子互作或與下游信號調(diào)控分子互作（Ｍｕｋｈｔａｒ??ｅｔａｌ．，?２０１１）。Ｃ端的ＬＲＲ結(jié)構(gòu)域在長度和形式上是多樣的，與特殊的配體互作的氨??基酸殘基與ＬＲＲ能夠形成一系列的Ｐ折疊（Ｍａｅｋａｗａｅｔａｌ．，?２０１１）。在沒有病原菌時，??ＮＢＳ－ＬＲＲ蛋白處于一種自我抑制的狀態(tài)，由ＬＲＲ控制的ＡＤＰ結(jié)合關(guān)閉狀態(tài)是穩(wěn)定??的。當Ｃ端的ＬＲＲ結(jié)構(gòu)域感知到效應(yīng)因子后，會改變蛋白Ｎ端和ＡＲＣ２之間的結(jié)合??狀態(tài)，從而使Ｒ蛋白結(jié)構(gòu)變得疏松更容易產(chǎn)生核苷酸改變。ＡＤＰ／ＡＴＰ之間的變化觸??發(fā)了蛋白中心ＮＢ－ＡＲＣ、Ｎ端ＴＩＲ／ＣＣ和Ｃ端ＬＲＲ結(jié)構(gòu)域之間的構(gòu)象變化，活性被??激發(fā)。在活性激發(fā)態(tài)，ＮＢ結(jié)構(gòu)域暴露出來，來觸發(fā)抵抗信號。ＡＴＰ水解反應(yīng)使蛋白??又回到結(jié)合八〇？的不活躍狀態(tài)（圖１－２）（�。常比纾保蓿常保�，２００９）。一般認為，１＾？８丄１１１１??

Ｊ？?！丨?／??圖１－１模式識別受體（ＰＲＲｓ）與多種病原菌誘導的Ｄ／ＰＡＭＰｓ??Ｆｉｇ．?１－１?Ｐａｔｔｅｒｎ?ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ?ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ?（ＰＲＲｓ）?ａｎｄ?ｄｉｖｅｒｓｅ?ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ?Ｄ／ＰＡＭＰｓ?（Ｍｅｎｇｉｓｔｅ，??２０１２）??ＮＢＳ－ＬＲＲ蛋白是一類己知的最大的Ｒ蛋白家族，植物中的ＮＢＳ－ＬＲＲ屬于ＡＡＡ＋??超家族的?ＳＴＡＮＤ?（ｓｉｇｎａｌ－ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ?ＡＴＰａｓｅｓ?ｗｉｔｈ?ｎｕｍｅｒｏｕｓ?ｄｏｍａｉｎｓ）?Ｐ－ｌｏｏｐＡＴＰ?酶??（Ｂｏｎａｒｄｉ?ｅｔ?ａｌ．，２０１１）。典型的ＮＢ－ＬＲＲ類蛋白能夠直接或間接的識別病原菌的效應(yīng)因??子來激活免疫反應(yīng)。這些蛋白包含一個核苷酸結(jié)合位點和富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域，中心??的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域是控制ＡＴＰ／ＡＤＰ結(jié)合狀態(tài)調(diào)控下游信號的分子開關(guān)（Ｔａｋｋｅｎ?ｅｔ??ａｌ．，２００９）。Ｎ?端的?ＣＣ?（ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ）或?ＴＩＲ?（Ｔｏｌｌ／Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－ｌ?ｒｅｃｅｐｔｏｒ）結(jié)構(gòu)域被認??為是信號識別結(jié)構(gòu)域，它們能夠與效應(yīng)因子互作或與下游信號調(diào)控分子互作（Ｍｕｋｈｔａｒ??ｅｔａｌ．，?２０１１）。Ｃ端的ＬＲＲ結(jié)構(gòu)域在長度和形式上是多樣的，與特殊的配體互作的氨??基酸殘基與ＬＲＲ能夠形成一系列的Ｐ折疊（Ｍａｅｋａｗａｅｔａｌ．

ｌｉｔ?（ＭＡＰ２Ｋ）和?２０?個?ＭＡＰＫ（ｄｅ?Ｚｅｌｉｃｏｕｒｔ?ｅｔ?ａｌ．，２０１６）。ＭＡＰＫ?的級聯(lián)因子、磷酸酶、細胞骨架、微絲微管相關(guān)蛋白的激活（Ｐｏｐｅｓｃｕｅｔａｌ．，ＭＡＰＫｓ，例如ＭＡＰＫ３、ＭＡＰＫ４和ＭＡＰＫ６，在生物和非生物脅迫化的特性（ｄｅ?Ｚｅｌｉｃｏｕｒｔ?ｅｔ?ａｌ．，２０１６）。在非生物脅迫中找ＭＡＰＫ信號在發(fā)現(xiàn)上游識別蛋白上，比如發(fā)現(xiàn)能夠活化下游ＭＡＰＫ的ＭＡＰ２ＫＳ，以及將激酶活化傳導到下游效應(yīng)蛋白并產(chǎn)生生理變化。我們通路是否與酵母高滲透下的ＭＡＰＫ通路相似（Ｈｏｈｍａｎｎ，?２００２）。朱的活化也許是由鹽和旱脅迫誘導的次級信號引起的，而不是最初的ｕ，２０１６）。??
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本文編號：2865836