楊樹(Populus)是我國北方重要的造林樹種,具有很高的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價值,但是其對水分缺乏和病原菌侵染敏感的特點嚴(yán)重限制了其生長與楊樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。探索楊樹對病害和干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制并鑒定關(guān)鍵調(diào)控基因,對通過基因工程技術(shù)快速培育抗逆性提高的楊樹新品種具有重要的理論意義與應(yīng)用前景。本論文在實驗室前期對楊樹干旱RNA-seq生物信息分析的基礎(chǔ)上,以響應(yīng)干旱脅迫并上調(diào)表達(dá)的microRNA472和楊樹特異的microRNA6445為研究對象,通過在84K楊(P.alba ×P.glandulosa).中分別過表達(dá)或沉默miR472a和楊樹特異的miR6445后,探索其在應(yīng)對干旱脅迫和病原菌侵染中的功能,為基因工程改良楊樹抗逆性提供了基因資源與理論依據(jù)。具體研究內(nèi)容如下:1.為了研究miR472a在植物抗病與抗旱中的作用,本論文構(gòu)建miR472a的過表達(dá)以及沉默載體,并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法在84K楊中進(jìn)行過表達(dá)和沉默miR472a,得到過表達(dá)株系miR472aOE(株系)和沉默株系STTM472a(株系)。本文分別用降解組數(shù)據(jù)、5'RACE、煙草共表達(dá)三種方法驗證了NBL1為miR472a的靶基因。同時熒光定量PCR顯示NBL1、NBL2、NBL3和NBL4在miR472aOE株系中下調(diào)表達(dá),在STTM472a株系中上調(diào)表達(dá),該結(jié)果也驗證了它們受miR472a靶向。另外,我們通過熒光定量 PCR 發(fā)現(xiàn)了 miR472 觸發(fā) phasiRNAs(SIR14、SIR16、SIR17、SIR21和SIR25)的產(chǎn)生。產(chǎn)生的phasiRNAs(如SIR16、SIR21和SIR25等)又靶向調(diào)控其他NBS-LRR(如NBL2等)基因,從而使NBS-LRR在正常生長條件下處于極低的表達(dá)水平。2.論文對野生型、過表達(dá)株系miR472aOE和沉默株系STTM472a分別進(jìn)行flg22、半活體寄生真菌膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和腐生真菌金黃殼囊孢菌(Cytospora chrysosperma)的處理,結(jié)果顯示:在flg22處理后,miR472aOE株系的H2O2進(jìn)發(fā)和胼胝質(zhì)堆積明顯低于野生型和STTM472a株系;在C.gloeosporioides處理后,野生型葉片中miR472a的表達(dá)量減少而NBL1-NBL4的表達(dá)量升高,miR472aOE株系的病斑面積明顯大于野生型和STTM472a株系;在C chrysosperma處理后,miR472aOE株系具有最小的病斑面積,JA/ET信號通路中的標(biāo)記基因ERF1基因最早在miR472aOE株系中出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。以上結(jié)果表明miR472a負(fù)調(diào)控了flg22和C.gloeosporioides觸發(fā)的免疫反應(yīng),而增強(qiáng)了植物對于C chrysosperma的抗性。3.對胡楊進(jìn)行干旱處理后發(fā)現(xiàn),miR472a在葉片(尤其是幼葉)中上調(diào)表達(dá),而在根中下調(diào)表達(dá)。為了探究miR472a在植物響應(yīng)干旱脅迫中的角色,論文在不同的轉(zhuǎn)基因楊樹株系中進(jìn)行了干旱處理,發(fā)現(xiàn)miR472aOE株系在干旱處理第4天出現(xiàn)萎蔫,而STTM472a株系和野生型在第六天才表現(xiàn)出萎蔫現(xiàn)象,這表明miR472負(fù)調(diào)控了楊樹的干旱脅迫響應(yīng)。而在正常生長條件下,miR472aOE株系比野生型和沉默株系表現(xiàn)出更大的葉面積和生物量,這表明miR472a正向調(diào)控了楊樹的生長發(fā)育。為了探究NBS-LRR基因是否參與了楊樹的干旱脅迫響應(yīng),我們選擇NBL1與NBL2在擬南芥中的同源基因突變體nbl1和nbl2來進(jìn)行甘露醇處理下的萌發(fā)率實驗,結(jié)果表明在正常和甘露醇處理條件下這兩個突變體的萌發(fā)率與野生型之間均無明顯差異。我們發(fā)現(xiàn)一個預(yù)測的miR472a靶基因FB1(F-box)基因在過表達(dá)株系中下調(diào)而在沉默株系中上調(diào)表達(dá),之后通過共轉(zhuǎn)煙草實驗證明其為miR472a的靶基因。在甘露醇處理下,FB1在擬南芥中的同源基因突變體fb1種子萌發(fā)率和根長增長量明顯低于野生型,在自然干旱條件下,fb1突變體更快出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象,這說明FB1正向調(diào)控了植物干旱脅迫響應(yīng)。而在正常條件下,突變體fb1具有更大的根長增長量、葉面積和生物量,這表明FB1可能負(fù)調(diào)控了生長發(fā)育�？傊�,miR472a可能通過靶向FB1正調(diào)控植物的生長發(fā)育而負(fù)調(diào)控干旱脅迫響應(yīng)。4、為了研究楊樹特異的miR6445在植物抗病與抗旱中的作用,本文分析了MIR6445b的啟動子序列,發(fā)現(xiàn)在其啟動子區(qū)存在MBS、CGTCA和TGACG-motif等與干旱脅迫和茉莉酸信號相關(guān)的順式作用元件。此后,構(gòu)建了 miR6445的沉默表達(dá)載體,在楊樹中沉默miR6445得到轉(zhuǎn)基因沉默株系STTM6445。熒光定量結(jié)果表明,miR6445可能的靶基因NAC112、NAC097、NAC152、NAC088在沉默株系STTM6445中表達(dá)量上調(diào)。對野生型和STTM6445株系進(jìn)行干旱處理后發(fā)現(xiàn),STTM6445株系在干旱第四天出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象,而野生型在第六天才開始出現(xiàn)萎蔫,STTM6445株系在干旱處理后的相對電導(dǎo)率明顯高于野生型。之后,對野生型和STTM6445株系進(jìn)行腐爛病菌處理實驗發(fā)現(xiàn),STTM6445株系在腐爛病菌處理后有更大的病斑面積,這表明miR6445可能正調(diào)控了植物的耐旱性和腐爛病抗性。綜上,miR472a通過靶向NBS-LRR基因以及觸發(fā)phasiRNAs負(fù)調(diào)控楊樹對膠孢炭疽菌的免疫反應(yīng),而增強(qiáng)植物對金黃殼囊孢菌的抗性;miR472a通過靶向F-box基因FB1負(fù)調(diào)控植物的干旱脅迫響應(yīng)信號,而促進(jìn)植物的生長發(fā)育。miR6445可能通過靶向NAC轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)控了楊樹抗旱性和對腐爛病菌的抗性。本研究為植物抗旱和抗病育種提供了基因資源和理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S763.7
【部分圖文】：

ＮＢＳ－ＬＲＲ蛋白是一類己知的最大的Ｒ蛋白家族，植物中的ＮＢＳ－ＬＲＲ屬于ＡＡＡ＋??超家族的?ＳＴＡＮＤ?（ｓｉｇｎａｌ－ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ?ＡＴＰａｓｅｓ?ｗｉｔｈ?ｎｕｍｅｒｏｕｓ?ｄｏｍａｉｎｓ）?Ｐ－ｌｏｏｐＡＴＰ?酶??（Ｂｏｎａｒｄｉ?ｅｔ?ａｌ．，２０１１）。典型的ＮＢ－ＬＲＲ類蛋白能夠直接或間接的識別病原菌的效應(yīng)因??子來激活免疫反應(yīng)。這些蛋白包含一個核苷酸結(jié)合位點和富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域，中心??的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域是控制ＡＴＰ／ＡＤＰ結(jié)合狀態(tài)調(diào)控下游信號的分子開關(guān)（Ｔａｋｋｅｎ?ｅｔ??ａｌ．，２００９）。Ｎ?端的?ＣＣ?（ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ）或?ＴＩＲ?（Ｔｏｌｌ／Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－ｌ?ｒｅｃｅｐｔｏｒ）結(jié)構(gòu)域被認(rèn)??為是信號識別結(jié)構(gòu)域，它們能夠與效應(yīng)因子互作或與下游信號調(diào)控分子互作（Ｍｕｋｈｔａｒ??ｅｔａｌ．，?２０１１）。Ｃ端的ＬＲＲ結(jié)構(gòu)域在長度和形式上是多樣的，與特殊的配體互作的氨??基酸殘基與ＬＲＲ能夠形成一系列的Ｐ折疊（Ｍａｅｋａｗａｅｔａｌ．，?２０１１）。在沒有病原菌時，??ＮＢＳ－ＬＲＲ蛋白處于一種自我抑制的狀態(tài)，由ＬＲＲ控制的ＡＤＰ結(jié)合關(guān)閉狀態(tài)是穩(wěn)定??的。當(dāng)Ｃ端的ＬＲＲ結(jié)構(gòu)域感知到效應(yīng)因子后，會改變蛋白Ｎ端和ＡＲＣ２之間的結(jié)合??狀態(tài)，從而使Ｒ蛋白結(jié)構(gòu)變得疏松更容易產(chǎn)生核苷酸改變。ＡＤＰ／ＡＴＰ之間的變化觸??發(fā)了蛋白中心ＮＢ－ＡＲＣ、Ｎ端ＴＩＲ／ＣＣ和Ｃ端ＬＲＲ結(jié)構(gòu)域之間的構(gòu)象變化，活性被??激發(fā)。在活性激發(fā)態(tài)，ＮＢ結(jié)構(gòu)域暴露出來，來觸發(fā)抵抗信號。ＡＴＰ水解反應(yīng)使蛋白??又回到結(jié)合八〇？的不活躍狀態(tài)（圖１－２）（�。常比纾保蓿常保�，２００９）。一般認(rèn)為，１＾？８丄１１１１??

Ｊ？?！丨?／??圖１－１模式識別受體（ＰＲＲｓ）與多種病原菌誘導(dǎo)的Ｄ／ＰＡＭＰｓ??Ｆｉｇ．?１－１?Ｐａｔｔｅｒｎ?ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ?ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ?（ＰＲＲｓ）?ａｎｄ?ｄｉｖｅｒｓｅ?ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ?Ｄ／ＰＡＭＰｓ?（Ｍｅｎｇｉｓｔｅ，??２０１２）??ＮＢＳ－ＬＲＲ蛋白是一類己知的最大的Ｒ蛋白家族，植物中的ＮＢＳ－ＬＲＲ屬于ＡＡＡ＋??超家族的?ＳＴＡＮＤ?（ｓｉｇｎａｌ－ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ?ＡＴＰａｓｅｓ?ｗｉｔｈ?ｎｕｍｅｒｏｕｓ?ｄｏｍａｉｎｓ）?Ｐ－ｌｏｏｐＡＴＰ?酶??（Ｂｏｎａｒｄｉ?ｅｔ?ａｌ．，２０１１）。典型的ＮＢ－ＬＲＲ類蛋白能夠直接或間接的識別病原菌的效應(yīng)因??子來激活免疫反應(yīng)。這些蛋白包含一個核苷酸結(jié)合位點和富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域，中心??的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域是控制ＡＴＰ／ＡＤＰ結(jié)合狀態(tài)調(diào)控下游信號的分子開關(guān)（Ｔａｋｋｅｎ?ｅｔ??ａｌ．，２００９）。Ｎ?端的?ＣＣ?（ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ）或?ＴＩＲ?（Ｔｏｌｌ／Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－ｌ?ｒｅｃｅｐｔｏｒ）結(jié)構(gòu)域被認(rèn)??為是信號識別結(jié)構(gòu)域，它們能夠與效應(yīng)因子互作或與下游信號調(diào)控分子互作（Ｍｕｋｈｔａｒ??ｅｔａｌ．，?２０１１）。Ｃ端的ＬＲＲ結(jié)構(gòu)域在長度和形式上是多樣的，與特殊的配體互作的氨??基酸殘基與ＬＲＲ能夠形成一系列的Ｐ折疊（Ｍａｅｋａｗａｅｔａｌ．

ｌｉｔ?（ＭＡＰ２Ｋ）和?２０?個?ＭＡＰＫ（ｄｅ?Ｚｅｌｉｃｏｕｒｔ?ｅｔ?ａｌ．，２０１６）。ＭＡＰＫ?的級聯(lián)因子、磷酸酶、細(xì)胞骨架、微絲微管相關(guān)蛋白的激活（Ｐｏｐｅｓｃｕｅｔａｌ．，ＭＡＰＫｓ，例如ＭＡＰＫ３、ＭＡＰＫ４和ＭＡＰＫ６，在生物和非生物脅迫化的特性（ｄｅ?Ｚｅｌｉｃｏｕｒｔ?ｅｔ?ａｌ．，２０１６）。在非生物脅迫中找ＭＡＰＫ信號在發(fā)現(xiàn)上游識別蛋白上，比如發(fā)現(xiàn)能夠活化下游ＭＡＰＫ的ＭＡＰ２ＫＳ，以及將激酶活化傳導(dǎo)到下游效應(yīng)蛋白并產(chǎn)生生理變化。我們通路是否與酵母高滲透下的ＭＡＰＫ通路相似（Ｈｏｈｍａｎｎ，?２００２）。朱的活化也許是由鹽和旱脅迫誘導(dǎo)的次級信號引起的，而不是最初的ｕ，２０１６）。??
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本文編號：2865836