水稻是對(duì)Cd吸收最強(qiáng)的大宗谷類作物,Cd通過根部-木質(zhì)部-韌皮部-籽粒的運(yùn)輸途徑進(jìn)入稻米中,經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體,對(duì)人體健康造成一定的危害。因此,了解低Cd水稻品種的分子機(jī)制,有利于解決我國稻米品質(zhì)安全的問題�；谏鲜鰡栴},本研究建立了基于親水作用色譜和反相色譜四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的水稻代謝物的分析方法,通過水培實(shí)驗(yàn)對(duì)低Cd水稻突變體和野生型的生態(tài)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定,篩選出二者的表型差異的Cd濃度及處理時(shí)間,同時(shí)利用代謝組學(xué)技術(shù)鑒定出差異特征代謝物,并對(duì)差異代謝產(chǎn)物參與的代謝途徑進(jìn)行闡述總結(jié),期望為進(jìn)一步揭示水稻品種的低Cd積累機(jī)制的相關(guān)研究提供理論依據(jù),主要研究結(jié)果如下:(1)采用Q-TOF/MS分析技術(shù),比較不同提取方法對(duì)水稻代謝物提取結(jié)果的影響,建立了RPLC和HILIC相結(jié)合的水稻代謝物分析方法。以檢出峰數(shù)目、初步鑒定的代謝物數(shù)量、種類以及代謝途徑為指標(biāo),探討了甲醇-三氯甲烷-水,甲醇-三氯甲烷-氨水,甲醇-MTBE-水3種提取方法和不同色譜系統(tǒng)對(duì)水稻代謝物提取及分離的效果。結(jié)果表明,甲醇-三氯甲烷-水對(duì)水稻代謝物的檢出覆蓋率最高,提取到的獨(dú)有代謝物最多,分別為苯甲酸、木樨草素、α-亞麻酸、烏頭酸、赤霉素A12醛、異牧荊素、L-谷氨酸;HSS T3和XBridge Amide色譜柱同時(shí)應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了對(duì)極性不同的代謝物較全面的檢測(cè),初步鑒定到16種有機(jī)酸、17種核苷酸、21種氨基酸、66種脂肪酸、11種磷脂、7種鞘脂,XBridge Amide在分離檢測(cè)磷脂和鞘脂類化合物方面具有明顯優(yōu)勢(shì);鑒定到的代謝物所涉及的代謝途徑為嘌呤代謝、嘧啶代謝、三羧酸循環(huán)、精氨酸代謝、脂肪酸代謝、磷脂代謝、鞘脂代謝、苯丙氨酸代謝以及維生素B2的合成。兩種色譜柱初步鑒定到的代謝物和涉及的代謝途徑均存在一定的互補(bǔ)性,該方法能夠應(yīng)用于水稻代謝表型的差異性研究。(2)采用低Cd水稻突變體和野生型為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行水培實(shí)驗(yàn),設(shè)置了0、0.1、5μmol/L的Cd濃度梯度處理,并對(duì)其進(jìn)行2 h、1 d、3 d、7 d、15 d的動(dòng)態(tài)取樣,研究了不同Cd濃度、取樣時(shí)間對(duì)水稻生長的影響。低Cd水稻突變體和野生型根長、株高、根部干重和地上部干重均隨取樣時(shí)間的延長而增加;當(dāng)添加Cd濃度(0.1μmol/L和5μmol/L)時(shí),低Cd水稻突變體的生長均沒有受到抑制作用,而對(duì)應(yīng)的野生型的生長隨Cd的增加受到不同程度的抑制,0.1μmol/L時(shí),野生型與其CK相比沒有受到明顯抑制,5μmol/L時(shí),野生型的生長受到較明顯的抑制;0.1μmol/L處理下,低Cd水稻突變體和野生型的根長、株高、根部干重和地上部干重在不同的取樣時(shí)間內(nèi)均無顯著差異,5μmol/L處理15 d后二者表現(xiàn)出顯著差異;添加Cd濃度(0.1μmol/L和5μmol/L)時(shí),低Cd水稻突變體根部和地上部的Cd含量在不同取樣時(shí)間內(nèi)均顯著低于野生型,其體內(nèi)可能存在某些化合物能夠抵抗Cd脅迫。(3)利用基于親水作用色譜和反相色譜四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的水稻代謝物分析方法對(duì)5μmol/L的Cd濃度處理15d的低Cd水稻突變體和野生型所產(chǎn)生的表型差異進(jìn)行差異代謝物研究。結(jié)果表明,低Cd水稻突變體和野生型在根部中共有25個(gè)差異代謝物,氨基酸類如丙氨酸、氨基丁酸、纈氨酸、天冬氨酸、脯氨酸,脂類如油酸、植物鞘氨醇、癸酸、PG(20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)/0:0)、PA(19:3(10Z,13Z,16Z)/0:0)、PA(18:2(9Z,12Z)/0:0)這些化合物發(fā)生顯著變化,對(duì)植物抵抗重金屬Cd作用較大;地上部中共有22個(gè)差異代謝物,有機(jī)酸類蘋果酸、檸檬酸、延胡索酸,維生素B類如核黃素(維生素B2)、吡哆醛(維生素B6)和泛酸,氨基酸類如羥脯氨酸變化顯著,其他氨基酸對(duì)水稻的耐Cd性機(jī)理需要進(jìn)行深一步的研究與探索。結(jié)合低Cd水稻突變體和野生型的差異代謝物可能參與的代謝途徑,主要是氨基酸代謝、有機(jī)酸代謝、維生素B類的合成、脂類代謝及三羧酸循環(huán),這些代謝途徑的變化可能與低Cd水稻突變體的較強(qiáng)耐Cd性有較大的聯(lián)系。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S511;X503.231
【部分圖文】：

圖 2.1 QC 樣品穿插于分析序列前、中、后的正離子模式 HILIC（a）和 RPLC（b）色譜疊加圖Figure 2.1 Overlaid hydrophilic interaction chromatography (HILIC) (a) and reversed phase liquid chromatography(RPLC) (b) maps of QC samples analyzed in positive mode at the beginning, middle, and end during the analysis worklist2.2.2 代謝物提取方法的選擇對(duì)比了不同提取溶劑對(duì)水稻中極性和非（弱）極性檢出峰的數(shù)量，結(jié)果見表 2.5。在混合質(zhì)量控制組樣品中，XBridgeAmide 色譜柱分離檢測(cè)到極性和非（弱）極性的檢出峰數(shù)量分別為 4296和 3589 個(gè)，HSS T3 色譜柱為 3936 和 3166 個(gè)。由表 2.5 可知，甲醇-三氯甲烷-水、甲醇-三氯甲烷-氨水、甲醇-MTBE-水 3 種方法提取的代謝物經(jīng) XBridgeAmide 和 HSS T3 分離檢測(cè)，其檢出峰覆蓋度均達(dá) 98%以上，無明顯差異。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 基于HILIC和RPLC Q-TOF/MS技術(shù)的水稻代謝物分析Q-TOF/MS 是四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，該技術(shù)不僅可以提供較精確的相對(duì)分子質(zhì)量，還能夠提供相關(guān)物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜。本研究利用 Q-TOF LC/MS 技術(shù)進(jìn)行水稻的代謝物分析，通過化學(xué)工作站軟件并借助 Metlin、Lipidmaps 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝物鑒定，結(jié)果見表 2.5，并對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，現(xiàn)以 3-脫氫莽草酸為例，提供該化合物的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖（圖 2.2），與 Metlin數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)二級(jí)譜圖進(jìn)行比對(duì)，其母離子和二級(jí)離子的質(zhì)量數(shù)吻合，說明本研究鑒定的代謝物的可靠性良好。在混合質(zhì)量控制組樣品中，XBridge Amide 色譜柱分離檢測(cè)到極性代謝物和非（弱）極性代謝物分別為 166 和 90 個(gè)，HSS T3 色譜柱為 111 和 108 個(gè)。由表 2.5 可知，3 種方法提取的代謝物覆蓋率均達(dá) 95%以上，而甲醇-三氯甲烷-水提取的代謝物全部覆蓋混合質(zhì)量控制組鑒定到的代謝物且獨(dú)有代謝物最多，分別是苯甲酸、木樨草素、α-亞麻酸、烏頭酸、赤霉素 A12醛、異牧荊素、L-谷氨酸，與甲醇-三氯甲烷-氨水和甲醇-MTBE-水相比，占有一定優(yōu)勢(shì)。

圖 2.3 XBridgeAmide 和 HSS T3 色譜柱檢測(cè)到的極性（a）和非（弱）極性（b）代謝物的互補(bǔ)性Figure2.3 Complementary analysis of detected polar (a) and non-(weak) polar (b) metabolites by XBridge Amide HSS T32.2.3.1 水稻中代謝物種類結(jié)果分析代謝組學(xué)的檢測(cè)對(duì)象主要是生物樣品中小分子量的代謝物，如氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸類等極性和非（弱）極性化合物（尹恒等, 2005）。目前，應(yīng)用于代謝物分離的液相色譜模式有 RPLC 和 HILIC，其中，反相色譜柱對(duì)非（弱）極性化合物的保留及分離有重要作用，反子對(duì)色譜可實(shí)現(xiàn)離子化合物的分離，但是因離子對(duì)試劑污染質(zhì)譜而限制了其應(yīng)用（Fan e2014）。HILIC 是近年色譜領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一（王媛等, 2008），它因具有親水性配基而更極性化合物的分離。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，脂類在 HILIC 色譜柱上具有較好的保留能力，尤其是磷脂（et al., 2014）。因此，HILIC 能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)極性和脂類代謝物的分離。本實(shí)驗(yàn)采用 XBridge A和 HSS T3 色譜柱對(duì)水稻中的代謝物進(jìn)行分離檢測(cè)，研究了兩種色譜柱在鑒定代謝物數(shù)量和上的互補(bǔ)性（圖 2.4）。由圖 2.4 可知，水稻中的代謝物主要分為 6 類：有機(jī)酸、核苷酸、氨基酸、脂肪酸、磷鞘脂。XBridgeAmide 和 HSS T3 色譜柱共同分離檢測(cè)到 6 種有機(jī)酸、11 種核苷酸、14 種氨基
【參考文獻(xiàn)】

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