蘋果輪紋病由致病真菌Botryosphaeria dothidea所引起,危害樹體,造成果實的腐爛,降低蘋果的產(chǎn)量和品質(zhì),嚴重制約蘋果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前,關于蘋果輪紋病菌的致病機理尚不清楚,阻礙蘋果抗病機制的研究。因此,深入解析輪紋病菌的致病機理,對于挖掘蘋果抗病基因、揭示抗病機制以及培育蘋果抗病新品種等都具有重要的理論研究意義和實際應用價值。在病原菌侵染的過程中,植物體內(nèi)通常伴隨有抗性物質(zhì)的運輸及激素水平的變化。膜泡運輸及乙烯信號轉(zhuǎn)導途徑在植物免疫過程中發(fā)揮重要作用。膜泡運輸是植物與外界環(huán)境之間進行信息交流和物質(zhì)交換的重要方式,在受到外界環(huán)境刺激時,植物可以通過抗性物質(zhì)的運輸及細胞壁成分的補充來應對各種脅迫。而膜泡運輸在蘋果與輪紋病菌相互作用中的具體調(diào)節(jié)機制尚未可知。乙烯通常作為生物脅迫中真菌和細菌病原體的毒力因子及防御反應的信號分子來參與植物的免疫反應。蘋果在受到輪紋病菌侵染時產(chǎn)生大量的乙烯,加重果實的發(fā)病,因此乙烯信號轉(zhuǎn)導途徑在病菌侵染時的作用也亟待發(fā)掘。本研究以蘋果為試驗材料,運用遺傳學及分子生物學手段首先明確了蘋果膜泡運輸中的突觸融合蛋白MdSYP121通過影響SA信號轉(zhuǎn)導途徑及氧化還原過程負調(diào)控蘋果對輪紋病菌的抗性;其次發(fā)現(xiàn)蘋果受到輪紋病菌侵染時產(chǎn)生大量的乙烯,導致果實的發(fā)病加重,而乙烯受體的超表達增強了植物對乙烯的敏感性,降低了蘋果對輪紋病菌的抗性。主要研究結(jié)果如下:(1)MdSYP121負調(diào)控蘋果對輪紋病菌的抗性。本研究通過對接種輪紋病菌后的蘋果進行轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn),MdSYP121處于蛋白互作網(wǎng)絡的中心位置,與多種抗病機制相關,可能在抵御輪紋病菌侵染中具有重要功能。進一步的試驗發(fā)現(xiàn),當接種輪紋病菌后,沉默MdSYP121的愈傷組織的病斑面積小于對照,而超表達MdSYP121的愈傷組織和擬南芥的病斑面積大于對照,說明MdSYP121負調(diào)控植物對輪紋病菌的抗性。通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),沉默MdSYP121的愈傷組織中SA合成相關基因EDS1、PAL、PAD4及信號轉(zhuǎn)導相關基因PR1、PR5、NPR1的表達水平高于對照,而超表達MdSYP121的轉(zhuǎn)基因愈傷組織和擬南芥中抗性相關基因的表達水平低于對照,由此推測MdSYP121可能通過影響SA介導植物抗病信號通路影響蘋果的抗病性。(2)通過對未接種輪紋病菌以及接種輪紋病菌后的野生型和沉默MdSYP121基因的愈傷組織進行轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn),MdSYP121主要通過調(diào)控氧化還原過程(GO:0055114)和氧化還原酶活性(GO:0016491)兩個生物過程影響蘋果對輪紋病菌的抗性。APX、CAT、POD和GST是與氧化還原反應密切相關的酶基因,通過qRT-PCR和酶活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),接種輪紋病菌后,上述基因的表達受到輪紋病菌的強烈誘導,同時相應氧化還原酶的活性也顯著提高,這說明MdSYP121可能通過調(diào)控氧化還原過程影響植物對輪紋病菌的抗性。(3)MdSYP121通過形成復合體在植物體內(nèi)發(fā)揮作用。亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)MdSYP121及MdSNAP33定位于細胞質(zhì)膜。通過BiFC和pull down試驗證明,MdSYP121可以與MdSNAP33互作,在質(zhì)膜上形成二元-SNARE靶膜復合體介導細胞的分泌過程。通過SDS-resistance試驗證明在蘋果中MdSYP121通過形成SNARE復合體發(fā)揮作用。(4)在受到輪紋病菌侵染時蘋果釋放出大量乙烯,導致輪紋病的發(fā)病程度加重。接種輪紋病菌后,隨著天數(shù)的增加,蘋果中乙烯的釋放量逐漸增多,病斑面積逐漸擴大。不同發(fā)育時期果實的乙烯釋放量和病斑面積有所不同。接種輪紋病菌后,盛花期后60天果實乙烯釋放量少,病斑面積小;盛花期后100天-160天果實乙烯釋放量增多,病斑面積增大;盛花期后180天乙烯釋放量減少,病斑面積也有所降低。qRT-PCR結(jié)果顯示,輪紋病菌通過誘導乙烯合成相關基因的表達而促進乙烯的合成。MdACS5A和MdACS5B是由傷害脅迫引發(fā)的植物乙烯合成的關鍵基因。盛花期后140天和160天時,輪紋病菌通過誘導植物乙烯合成關鍵基因MdACS5A和MdACS5B的表達顯著提高乙烯的合成。進一步的研究發(fā)現(xiàn),與未接種輪紋病菌的果實相比,盛花期后60天果實接種輪紋病菌后乙烯釋放量相對較少,MdPR2、MdPR4、MdPR5、MdPR8等抗性相關基因的表達量較高;而盛花期后140天和160天乙烯釋放量顯著增加,PR相關基因表達水平下降。因此,輪紋病菌可能通過促進蘋果中乙烯的生物合成,抑制蘋果抗性相關基因表達,降低蘋果的抗病性。(5)超表達蘋果乙烯受體增強植物對乙烯的敏感性。將蘋果乙烯受體MdEIN4、MdETR1、MdETR2和MdERS1分別轉(zhuǎn)化擬南芥植株,“三重反應”試驗證明,當ACC存在時,抑制了擬南芥下胚軸的伸長,超表達MdEIN4的擬南芥植株下胚軸長度為對照擬南芥的0.67倍,而MdETR1、MdETR2和MdERS1的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株下胚軸長度與對照類似,說明MdEIN4在蘋果乙烯信號轉(zhuǎn)導途徑中對乙烯更為敏感。(6)蘋果乙烯受體負調(diào)控蘋果對輪紋病菌的抗性。對超表達乙烯受體MdEIN4、MdETR1、MdETR2和MdERS1的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片接種輪紋病菌后發(fā)現(xiàn),超表達乙烯受體的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片病斑面積和菌絲擴展程度高于對照和乙烯不敏感型突變體ein2,其中超表達Md EIN4的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片病菌擴展面積及菌絲侵染程度最大。qRT-PCR結(jié)果顯示,接種輪紋病菌后,超表達MdEIN4的擬南芥中PR基因的表達量最低。當用CoCl_2處理后,MdEIN4轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片病斑面積和病菌侵染程度顯著降低,PR基因的表達水平升高,推測MdEIN4轉(zhuǎn)基因擬南芥可能通過影響抗性相關基因的表達而降低蘋果對輪紋病菌的抗性。
【學位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S436.611.1
【部分圖文】：

突觸融合蛋白 MdSYP121 和乙烯負調(diào)控蘋果對輪紋病菌抗性的研究SynaPtobrivin，Betlp 及 BoslP 組成；第二類 SNAREs 蛋白不含跨修飾錨定于膜，如 SNAP25 含 2 個 SNAREs 基序，中間間隔一胱氨酸可被棕櫚酰化，進而使 SNAP25 附著于質(zhì)膜；第三類 SNARE 基序，如 VAMP7 及 Syntaxin 變異體，其羧基端有半胱氨氨酸的修飾將其錨定于質(zhì)膜（Kwon et al., 2008）。 SNARE 蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)的 SNARE 蛋白有 30 多種，均為膜結(jié)合蛋白，所有蛋白都的 SNARE 基序，該基序可介導 SNAREs 各亞單位形成核心復合通常包括 1 個突觸融合蛋白（Syntaxin，含有 Qa-SNARE 結(jié)蛋白（含有 Qb-和 Qc-SNARE 結(jié)構(gòu)域）和 1 個 VAMPs 蛋白（Vesicrotein）（含有 R-SNARE 結(jié)構(gòu)域）（圖 1-1）。

進而激活ERFs、EBF2、PORA和PORB等下游基因表達，使乙烯信號向下游傳遞完成乙烯應答反應（Ju et al., 2012；Merchante et al., 2015；An et al., 2010）。圖1-2 擬南芥乙烯信號轉(zhuǎn)導途徑示意圖（Guo and Ecker, 2004）Fig. 1-2 Schematic diagram of the ethylene signal transduction pathway in Arabidopsis（Guo and Ecker, 2004）1.4.1 植物乙烯信號轉(zhuǎn)導途徑乙烯信號轉(zhuǎn)導途徑是由乙烯受體對乙烯的感知所開始的。Chang 等從擬南芥中鑒定了第一個乙烯受體 ETR1，隨后又分離得到了 ETR2，EIN4，ERS1 和 ERS2 四種乙烯受體（Chang et al., 1993；Hua et al., 1995；Hua et al., 1998；Sakai et al., 1998）。乙烯受體為雙組分受體，在含有乙烯結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 N-末端區(qū)域具有三個跨膜 α-螺旋，接著是 GAF 結(jié)構(gòu)域和類似原核組氨酸激酶的結(jié)構(gòu)域（HK）（Schaller and Bleecker,1995）。GAF 結(jié)構(gòu)域涉及受體間的非共價蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，可能有助于調(diào)節(jié)信號輸出（Gao et al., 2008）。C 末端為信號輸出結(jié)構(gòu)域（Gao and Stock, 2009）。在擬南芥中，乙烯受體根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點可以分為兩類：I 類包括 ETR1 和 ERS1；II 類包括 ETR2

山東農(nóng)業(yè)大學博士學位論文3 結(jié)果與分析3.1 蘋果 MdSYP121 基因的分離及生物學功能分析為了研究蘋果抵御輪紋病菌侵染的分子機制，我們對接種輪紋病菌的‘富士’蘋果果實進行了轉(zhuǎn)錄組測序分析。通過分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MDP0000709455處于植物抗病網(wǎng)絡的重要位置（圖3-1），并且MDP0000709455的同源基因在大麥和擬南芥抵御白粉病菌侵染過程中起到重要的作用（Collins et al., 2003），因此我們推測該基因在蘋果抵御輪紋病菌侵染中具有重要作用。
【參考文獻】

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1 李保華;王彩霞;董向麗;;我國蘋果主要病害研究進展與病害防治中的問題[J];植物保護;2013年05期

2 王培松;劉保友;欒炳輝;張偉;王英姿;;蘋果輪紋病菌孢子田間釋放規(guī)律[J];湖北農(nóng)業(yè)科學;2011年19期

3 伍利芬;畢陽;李紅霞;高雄杰;李科瑋;;蘋果酸處理對蘋果黑斑病的抑制及抗性酶的誘導[J];甘肅農(nóng)業(yè)大學學報;2010年03期

4 于秋香;邵建柱;徐繼忠;;蘋果砧木雜交后代皮孔性狀與抗輪紋病菌侵染的關系[J];河北農(nóng)業(yè)大學學報;2010年02期

5 趙玲玲;宋來慶;李元軍;于青;劉美英;張振英;姜中武;;抗輪紋病蘋果砧木‘煙砧一號’抗病機理初探[J];園藝學報;2010年02期

6 李廣旭;楊華;高圣華;張治東;金城;;輪紋病菌侵染對不同抗性蘋果品種膜透性及防御酶的影響[J];植物保護學報;2006年02期

7 李廣旭,高艷敏,楊華,劉秀春,孫凌俊,王佳軍;輪紋病菌在蘋果枝干上侵入途徑的掃描電鏡觀察[J];果樹學報;2005年02期

8 沈永波,李廣旭,高艷敏,張桂玲,馬貴軍,孫謀福;蘋果果實內(nèi)含物與輪紋病抗性的關系[J];北方果樹;2003年06期

9 劉海英,李川,范永山,侯保林;影響蘋果果實輪紋病抗性的寄主因素及相關性分析[J];河北農(nóng)業(yè)大學學報;2003年01期

10 陳建中,章鎮(zhèn),黃賽芹,高志紅;外源綠原酸對蘋果抗病相關酶的影響[J];果樹學報;2003年01期

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1 柏素花;蘋果輪紋病防御相關基因的鑒定及功能分析[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2012年

本文編號：2857770