發(fā)布時間：2020-10-13 12:11

　　 松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)是松樹的毀滅性病害松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)的主要媒介昆蟲,防控松墨天�？梢杂行Э刂扑刹木�蟲病的傳播。昆蟲嗅覺是昆蟲多項生理行為的基礎(chǔ),但目前對松墨天牛的嗅覺識別機制還尚未明確,而嗅覺共受體(odorant receptor coreceptor,Orco)在昆蟲嗅覺系統(tǒng)中發(fā)揮作用,且其在不同昆蟲體內(nèi)高度保守而具有一定的研究前景。對昆蟲嗅覺深入研究,廣泛應(yīng)用于害蟲管理,是害蟲防治的新手段。為了開發(fā)更高效的調(diào)控技術(shù)和設(shè)計出特定嗅覺蛋白,在對松墨天牛嗅覺識別機制研究的基礎(chǔ)上還要探究其各嗅覺受體相關(guān)蛋白和功能。本研究基于嗅覺受體的研究進展,對松墨天牛orco基因組結(jié)構(gòu)展開分析,深入探究其表達特征,并對受體基因orco進行RNA干擾實驗,主要結(jié)論如下:為系統(tǒng)的分析松墨天牛嗅覺識別過程中相關(guān)的嗅覺受體,本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對松墨天牛成蟲觸角構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組本,轉(zhuǎn)錄組測序共得到53,015個Unigenes,平均長度745 bp,屬于正常范圍。在松墨天牛成蟲觸角轉(zhuǎn)錄本中挖掘得到8個CSPs,53個IRs,12個OBPs,37個ORs,1個orco,將挖掘到的orco與其他昆蟲的orco進行進化樹構(gòu)建,發(fā)現(xiàn)其與鞘翅目同屬昆蟲光肩星天牛親緣關(guān)系最為接近,與其他昆蟲則較遠,這與生物學進化地位相對一致,說明orco在進化過程中相對保守又有一定的變異,而松墨天牛orco全長序列的鑒定為進一步探索嗅覺受體在氣味識別過程中所起的作用和功能提供前期基礎(chǔ)。通過PCR擴增技術(shù)成功克隆得到松墨天牛orco氣味受體基因,orco基因全長1,434 bp,共編碼477個氨基酸。通過對松墨天牛嗅覺受體orco基因進行克隆、鑒定和生物信息學分析,松墨天牛Orco受體蛋白是一個具有七個跨膜結(jié)構(gòu)的疏水性蛋白,未預測到具有信號肽位點,同時Orco氨基酸序列中共存在21個N-糖基化修飾位點,47個磷酸化位點,說明了松墨天牛Orco可能具有的生物學功能。運用RT-qPCR技術(shù)對松墨天牛成蟲不同組織與不同發(fā)育時期進行表達差異分析,松墨天牛Orco在成蟲觸角中高表達,在其他部位如頭、胸、腹、足、翅膀等也有檢測到,且表達量表現(xiàn)為頭腹翅膀足胸。在松墨天牛成蟲不同發(fā)育時期中,Orco在成蟲末期中表達量顯著高于其他發(fā)育時期,而且雌蟲觸角表達量明顯高于雄蟲。對松墨天牛表達模式的研究可為下一步鑒定其功能提供理論依據(jù)。利用RNAi技術(shù)沉默松墨天牛orco基因,通過RT-qPCR證明RNAi技術(shù)在鞘翅目昆蟲松墨天牛中的成功應(yīng)用,通過注射dsRNA,Orco表達量顯著降低。EAG及行為學測定結(jié)果顯示,松墨天牛orco基因的沉默會降低引誘劑、松節(jié)油及性信息素引起的電位變化,也會使其對氣味分子的行為趨向表現(xiàn)為隨機性,即orco基因的沉默可能會對松墨天牛的正常的嗅覺識別過程造成影響。對orco在松墨天牛嗅覺識別過程中所發(fā)揮的生物學功能以及利用該基因揭秘松墨天牛嗅覺傳導機制奠定基礎(chǔ),為松墨天牛靶標防治提供了潛在的可能,有助于研發(fā)防控害蟲的新技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)其在不同昆蟲體內(nèi)的高度保守性以及在嗅覺識別機制中的獨特地位,預示其可能是破壞昆蟲嗅覺信號的一個潛在靶標,從而通過嗅覺干擾防控松墨天牛數(shù)量限制松材線蟲病的傳播。這將為松材線蟲病的綜合防治提供新方向。預期結(jié)果不僅為以松墨天牛Orco作為潛在的分子靶標開發(fā)和利用新型高效的殺蟲劑、引誘劑和驅(qū)避劑打下堅實的基礎(chǔ),而且對研究松墨天牛寄主選擇行為機制提供科學依據(jù),同時為探究松墨天牛行為調(diào)控和控制松材線蟲病傳播發(fā)揮著重要作用。
【學位單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S763.38
【部分圖文】：

棄廢液；的 2mL 收集管，加入 400μLRNs，棄廢液；L 收集管，加入 500 μL RNAWa廢液； 2 mL 收集管，加入 500 μL RNAs，棄廢液；附柱移至新的 1.5 mL 離心管中，r（70℃預熱）加入吸附柱，室溫。定 RNA 樣品的濃度，Qubit 2.0 測性，是為了確保樣品可以到達轉(zhuǎn) Illumina 測序程見圖 2-1：

圖 2-2 松 牛 Unigene 長度分布圖Fig. 2-2 Length distribution of Unigenes in M. alternatus Hope.3 預測蛋白質(zhì)的注釋所有組裝的 Unigenes 用作 NR，Swiss-Prot，GeneOontology（GO），直群集（COG），KOG 和 KEGG 數(shù)據(jù)庫的輸入 BLAST 和 HMMER 參數(shù) E 設(shè)置為 10-5 和 10-10，我們是能夠獲得 23,748 個 Unigenes 的注釋信息，區(qū)的 44.79％，其余的單基因序列（55.21％）在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中具有無顯著配，這說明其中可能含有新的序列信息，或者含有大量鞘翅目特異性昆蟲轉(zhuǎn)錄本。有 12,651 個 Unigenes 在 NR 數(shù)據(jù)庫中被注釋，參考標準選取 E 結(jié)果，松墨天牛有 34.28%的序列與同屬鞘翅目的赤擬谷盜（Tribostaneum）具有同源性。有 10.89%的序列與同屬鞘翅目的中歐山松大Dendroctonus ponderosae）具有同源性，而比對到其他昆蟲的序列所占比.14%（圖 2-3）。

圖 2-2 松 牛 Unigene 長度分布圖Fig. 2-2 Length distribution of Unigenes in M. alternatus Hope測蛋白質(zhì)的注釋有組裝的 Unigenes 用作 NR，Swiss-Prot，GeneOontology（GO）（COG），KOG 和 KEGG 數(shù)據(jù)庫的輸入 BLAST 和 HMMER 參數(shù)為 10-5 和 10-10，我們是能夠獲得 23,748 個 Unigenes 的注釋信息 44.79％，其余的單基因序列（55.21％）在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中具有無說明其中可能含有新的序列信息，或者含有大量鞘翅目特異性昆本。有 12,651 個 Unigenes 在 NR 數(shù)據(jù)庫中被注釋，參考標準選取，松墨天牛有 34.28%的序列與同屬鞘翅目的赤擬谷盜（um）具有同源性。有 10.89%的序列與同屬鞘翅目的中歐山松roctonus ponderosae）具有同源性，而比對到其他昆蟲的序列所占（圖 2-3）。
【參考文獻】

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本文編號：2839152