油菜黑脛病(blackleg of oilseed rape)和油菜莖基潰瘍病(stem canker of oilseed rape)分別由Leptosphaeria biglobosa(Lb)和L.maculans(Lm)引起,其中Lb含6個亞類,包括蕓薹亞類(L.biglobosa‘brassicae’,簡稱Lbb)和加拿大亞類(L.biglobosa‘canadensis’,簡稱Lbc),危害油菜的Lm只有一個亞類,即Lm蕓薹亞類(L.maculans‘brassicae’,簡稱Lm)。目前,我國油菜產(chǎn)區(qū)僅發(fā)現(xiàn)Lbb和Lbc存在,沒有Lm存在。因而,Lm是我國的一個對外檢疫對象。Lb的兩個亞類(Lbb和Lbc)和Lm在油菜上造成的癥狀相近,其培養(yǎng)特征相似,難以鑒定。本研究基于環(huán)節(jié)導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP)建立了一種高效快速、準(zhǔn)確靈敏、簡便易行的檢測體系,對Lm、Lbb和Lbc實(shí)施高通量快速檢測。取得的主要研究結(jié)果如下:(1)根據(jù)ITS-rDNA序列設(shè)計了檢測Lb(包括Lbb和Lbc)以及Lm的特異性LAMP引物,并對環(huán)引物及其數(shù)目進(jìn)行了篩選,最終確定保留了一條環(huán)引物檢測Lb,保留兩條環(huán)引物檢測Lm。利用了RAPD技術(shù)(Random Amplified Polymorphic DNA)獲得了特異性檢測Lbb的LAMP引物,根據(jù)Lbc的ITS序列,利用人工堿基錯配原理獲得了特異性檢測Lbc的LAMP引物。(2)以LAMP檢測Lb體系為例,優(yōu)化了反應(yīng)體系中的試劑濃度(dNTPs、Mg~+、F3/B3、FIP/BIP、LF/LB),明確了最適的LAMP反應(yīng)體系,并對反應(yīng)時間和溫度進(jìn)行了優(yōu)化,明確了最佳反應(yīng)溫度為65℃,最佳反應(yīng)時間為40 min。對檢測Lb、Lbb、Lbc和Lm這4個LAMP體系的特異性、靈敏性和實(shí)用性等進(jìn)行了評估。結(jié)果表明:所設(shè)計的4組引物特異性好,能特異性檢測出目標(biāo)真菌,而對雜菌及近緣種真菌則不能擴(kuò)增。檢測靈敏性高,對目標(biāo)真菌模板DNA的檢測極限達(dá)到fg級,較常規(guī)PCR的靈敏度提高100~1000倍。而且具有實(shí)用性,可用于檢測病組織中的目標(biāo)真菌,也可用于快速鑒定Lbb、Lbc和Lm。(3)對提取目標(biāo)真菌和病組織中的DNA方法進(jìn)行了優(yōu)化,利用TE緩沖液和NaOH溶液分別對目標(biāo)真菌菌絲、分生孢子以及油菜病組織進(jìn)行裂解,以釋放其中的DNA,整個提取過程僅用時2 min,提取的DNA能滿足LAMP檢測要求。從DNA提取到完成LAMP反應(yīng)僅需1 h。上述研究結(jié)果為快速準(zhǔn)確及高通量檢測Lbb、Lbc和Lm奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S435.654
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.油菜黑脛病及其危害
        1.1.油菜黑脛病和莖基潰瘍病研究簡史
        1.2.油菜黑脛病菌和莖基潰瘍病菌分類
        1.3.病害循環(huán)、寄主范圍及危害癥狀
        1.4.油菜黑脛病和莖基潰瘍病全球分布及流行
        1.5.油菜黑脛病和莖基潰瘍病對我國油菜生產(chǎn)的潛在威脅
        1.6.油菜黑脛病和莖基潰瘍病防治方法
    2.油菜黑脛病菌和莖基潰瘍病菌檢測技術(shù)
        2.1.傳統(tǒng)鑒定技術(shù)
        2.2.基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的檢測技術(shù)
        2.3.環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)檢測技術(shù)
    3.本課題的意義和研究內(nèi)容
        3.1.課題的意義
        3.2.課題研究內(nèi)容
第二章 油菜莖基潰瘍病菌LAMP檢測技術(shù)建立與應(yīng)用
    1.試驗(yàn)材料
        1.1.供試菌株
        1.2.主要試驗(yàn)儀器
        1.3.培養(yǎng)基
        1.4.試驗(yàn)試劑
    2.試驗(yàn)方法
        2.1.菌株的活化、培養(yǎng)和收集
        2.2.菌株基因組DNA的提取
        2.3.引物設(shè)計
        2.4.LAMP檢測Lm體系建立以及反應(yīng)條件優(yōu)化
        2.5.LAMP產(chǎn)物判斷方法
        2.6.特異性檢測
        2.7.LAMP和 PCR靈敏度檢測
        2.8.實(shí)用性檢測
    3.結(jié)果與分析
        3.1.檢測Lm的 LAMP反應(yīng)條件
        3.2.LAMP引物檢測的特異性
        3.3.LAMP檢測Lm的靈敏度
        3.4.LAMP檢測Lm的實(shí)用性
    4.討論
第三章 檢測油菜黑脛病菌的LAMP技術(shù)建立和優(yōu)化
    1.試驗(yàn)材料
        1.1.供試菌株
        1.2.主要試驗(yàn)儀器
        1.3.培養(yǎng)基
        1.4.試驗(yàn)試劑
    2.試驗(yàn)方法
        2.1.菌株活化、培養(yǎng)和菌絲收集
        2.2.基因組DNA提取
        2.3.引物設(shè)計
        2.4.檢測Lb的 LAMP體系建立以及反應(yīng)條件優(yōu)化
        2.5.LAMP產(chǎn)物判斷方法
        2.6.特異性檢測
        2.7.LAMP和 PCR檢測靈敏度測定
        2.8.實(shí)用性檢測
    3.結(jié)果與分析
        3.1.LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化
        3.2.LAMP引物特異性
        3.3.LAMP檢測油菜黑脛病菌的靈敏度
        3.4.LAMP檢測油菜黑脛病菌的實(shí)用性
    4.討論
第四章 檢測油菜黑脛病菌亞類的LAMP技術(shù)建立與應(yīng)用
    1.試驗(yàn)材料
        1.1.供試菌株
        1.2.主要試驗(yàn)儀器
        1.3.培養(yǎng)基
        1.4.試驗(yàn)試劑
    2.試驗(yàn)方法
        2.1.菌株活化、培養(yǎng)和菌絲收集
        2.2.Lbb和 Lbc基因組DNA的提取
        2.3.引物設(shè)計
        2.4.LAMP體系建立以及反應(yīng)條件優(yōu)化
        2.5.LAMP產(chǎn)物判斷方法
        2.6.特異性檢測
        2.7.LAMP和 PCR靈敏度檢測
        2.8.實(shí)用性檢測
        2.9.DNA快速提取方法優(yōu)化
    3.結(jié)果與分析
        3.1.LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化
        3.2.LAMP檢測Lbb和 Lbc的引物特異性
        3.3.LAMP和 PCR檢測Lbb和 Lbc的靈敏度
        3.4.LAMP檢測Lbb和 Lbc的實(shí)用性
        3.5.LAMP對Lbb的快速鑒定
    4.討論
第五章 全文總結(jié)和展望
    1.總結(jié)
    2.展望
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士期間發(fā)表的專利
致謝

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本文編號：2838854