多花黃精為百合科黃精屬植物,被《中國藥典》(2015年版)收錄,是一味藥食同源的中藥材。截至2018年,人工栽培已成為黃精主要生產(chǎn)模式,為此栽培過程中常受到多種病原菌侵害,如葉斑病、炭疽病等。在浙江省黃精種植基地中,發(fā)現(xiàn)一種發(fā)病比較嚴重的病害,該病的發(fā)病癥狀為在葉片頂端先形成病斑,后不斷擴大,最終整個植株葉片枯死,為區(qū)分此種癥狀,起名為多花黃精葉枯病,該病害嚴重影響多花黃精根莖的生長和產(chǎn)量。為此,本文對多花黃精葉枯病的病原、多花黃精的內(nèi)生菌、生防菌的防病效果及其拮抗機制和促生機理進行了研究,具體結(jié)果如下:1、對多花黃精的感病植株進行病原菌的分離、鑒定,分離得到5株真菌,對其進行致病性測定,發(fā)現(xiàn)只有菌株PC-4具有致病性。根據(jù)形態(tài)學、rDNA-ITS和TEF-1α序列同源性分析,對該病害的致病菌種進行鑒定,最終確定導致多花黃精葉枯病的病原菌為尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum。2、從多花黃精根莖中分離獲得11株內(nèi)生細菌,經(jīng)鑒定分別屬于3個屬,其中芽胞桿菌屬為多花黃精內(nèi)生細菌的優(yōu)勢菌屬,采用平板對峙法篩選出一株對尖孢鐮刀菌F.oxysporumPC-4具有抗菌效果的內(nèi)生拮抗菌ZJU-3,通過形態(tài)學觀察、生理生化測定、16S rDNA和gyrB基因序列同源性分析,最終鑒定菌株ZJU-3鑒定為貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis。3、盆栽實驗測定B.velezensisZJU-3的生防效果,發(fā)現(xiàn)OD600=0.5生防菌液的病情指數(shù)為39.5%,而只接種病原菌的對照組的病情指數(shù)為70.8%,防病效果為44.2%,可見B.velezensisZJU-3可有效降低發(fā)病率。4、多花黃精和滇黃精組培試驗中,發(fā)現(xiàn)B.velezensB.ZJU-3發(fā)酵液均可以對株高、鮮重有促生作用,對葉片中葉綠素含量無影響。溫室栽培試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株對多花黃精具有顯著的促生效果,根長和單株根數(shù)明顯高于對照組。對發(fā)酵液中激素種類進行利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)進行分析,發(fā)現(xiàn)B.velezensis ZJU-3產(chǎn)生多種植物內(nèi)源激素如IAA、kinetin、zeatin、GA3,其濃度依次為8.29 ng/mL、21.34 ng/mL、0.02 ng/mL、0.07 ng/mL。5、利用濃度梯度法對菌株進行利福平的抗性誘導,篩選出保持抗菌活性的抗利福平的突變體Rif-B.velezensis ZJU-3,其對利福平的抗性達到150 μg/mL。通過葉片接種、組織分離,發(fā)現(xiàn)葉片內(nèi)Rif-B.velezensis ZJU-3菌株數(shù)量為2×105個/g。6、菌絲生長速率測定結(jié)果顯示,拮抗菌ZJU-3無菌發(fā)酵液對F.oxysporum PC-4菌絲生長均有抑制作用,隨著培養(yǎng)基中發(fā)酵液添加比例的增加,抑菌效果增強,當加入5%發(fā)酵濾液時,菌落直徑為3.78cm,對照為4.87cm,抑制率為22.3%。對B.velezensisZJU-3發(fā)酵液抗菌活性穩(wěn)定性分析,發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌B.velezensisZJU-3發(fā)酵液抗菌活性不受溫度、pH、蛋白酶K和金屬鹽離子影響。7、抑菌譜測定試驗發(fā)現(xiàn)拮抗菌ZJU-3對鐵皮石斛炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、大豆 炭疽病(C.truncatum)、小麥赤霉病菌(F.graminearum)、西紅花茄病鐮刀菌(F.solani)、棉花立枯絲核病菌(Rhizoctoniasolani)、西瓜枯萎病菌(F.oxyporum f.sp.niveum)的菌絲都有較強的抑制作用,抑菌效果分別為71.8%、79%、55%、58.4%、75.1%和66.4%,且部分病菌菌絲縮短變粗、扭曲、變黑、表面出現(xiàn)褶皺,產(chǎn)孢量明顯減少,可說明該菌株具有一定的廣譜抗性。8、抑菌物質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn),B.velezensis ZJU-3能夠產(chǎn)生嗜鐵素、蛋白酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶,不分泌幾丁質(zhì)酶。根據(jù)脂肽類抗生素合成相關基因序列(fenA、sfp、ituA)對目標菌株進行PCR擴增,發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌B.velezensB.ZJU-3的基因組中可能存在泛革素、伊枯草菌素和表面活性素的代謝合成操縱子序列。MALDI-TOF-MS檢測結(jié)果表明生防菌B.velezensis能夠產(chǎn)生豐富的脂肽類抗生素,包括泛革素、表面活性素和伊枯草菌素三個家族。利用鹽酸沉淀和甲醇抽提法獲得了菌株ZJU-3發(fā)酵液中脂肽粗提物,確定該脂肽粗提物具有明顯抑制尖孢鐮刀菌菌絲生長的能力,抑制率達到51.6%。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S435.672
【部分圖文】：

在葉片頂端先形成病斑，后不斷擴大，在葉部形成橢圓形或不規(guī)則的水浸逡逑狀病斑，葉片邊緣變黃褐色，最終整個葉片枯死，病葉枯死后，不脫落，懸掛于莖稈。逡逑如圖２．１所示。與周先治（２０１７）報道的黃精枯萎病癥狀相似，但是其報道中病原菌逡逑只鑒定到鐮刀菌屬，尚未進一步鑒定到種。逡逑遇邋１９＾１逡逑圖２．１多花黃精感病植株癥狀逡逑Ｆｉｇ．２．１邋Ｓｙｍｐｔｏｍｓ邋ｏｆ邋ｎａｔｕｒａｌｌｙ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｐｌａｎｔｓ邋ｏｆ邋Ｐ．邋ｃｙｒｔｏｎｅｍａ邋Ｈｕａ逡逑２．３．２病原菌分離逡逑以感病的多花黃精葉片作為材料，根據(jù)菌落外觀形態(tài)、顏色，去除表觀上相同的逡逑菌株（見圖２．２），得到５株真菌（ＰＣ－丨？ＰＣ－５）。逡逑Wｎｎｍ逡逑圖２．２分離得到的不同菌株的形態(tài)逡逑Ｆｉｇ．２．２邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｏｆ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｐｌａｎｔｓ邋ｏｆ邋Ｐ．邋ｃｙｒｔｏｎｅｍａ邋ｌｌｕａ逡逑１４逡逑

菌株編號邐菌落特征逡逑Ｓｔｒａｉｎ邋ｎｕｍｂｅｒ邐Ｃｏｌｏｎｙ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ逡逑ｐｃ＾ｉ邐菌落初白色，后為灰白色，有黑色顆粒逡逑ＰＣ－２邐菌落灰黑色，表面形成黑色球形粒點逡逑ＰＣ－３邐菌落初白色，后為灰白色，表面干燥，菌落不ＰＣ－４邐菌落初期呈淡紅色或白色，后期出現(xiàn)淡紫色色ＰＣ－５邐菌落呈白色絨毛狀，干燥，不透明逡逑的致病性測定逡逑離物接種５盆長勢一致的多黃黃精盆栽苗，每個處理接現(xiàn)ＰＣ－４致�。ㄒ妶D２．３），接種１０ｄ后，葉片接種位置向葉片邊緣擴散，培養(yǎng)３周后，接種ＰＣ－４的植株葉片干

得序列在ＮＣＢＩ網(wǎng)站進行ＢＬＡＳＴ比對，確定該分離菌株為接種菌株，完成柯赫氏法逡逑則，可以認定ＰＣ－４為多花黃精葉枯病的致病菌。逡逑圖２．４邋ＰＣ－４菌株的初次分離菌落形態(tài)與接種后發(fā)病葉片再次分離菌株形態(tài)對比逡逑Ｆｉｇ邋．２．４．邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｌｏｎｙ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｓｔｒａｉｎ邋Ｐ（邋－４邋ｕｎｃｉ邋ｔｈｅ邋ｓｔｒａｉｎ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｌａｓｔ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ．逡逑２．３．４菌株ＰＣ－４的形態(tài)特征逡逑２．３．４．１菌落特征逡逑菌落初期呈淡紅色或白色，后期顏色加深，出現(xiàn)淡紫色或深紫色色素。氣生菌絲逡逑豐富且呈絨毛狀。培養(yǎng)皿背面觀察，菌落初期呈白色且色澤均勻，后期呈淡紅色至紫逡逑色。多次純化后，部分純化菌落會出現(xiàn)顏色變化的情況。逡逑３ｄ邐６ｄ邐９ｄ邐ｌｉｄ逡逑ｏｎｎｎ逡逑ｈ邋□□□□逡逑圖２．５不同培養(yǎng)時間的菌株ＰＣ－４的菌落形態(tài)逡逑Ｆｉｇ．２．５邋Ｃｏｌｏｎｉｅｓ邋ｏｆ邋ｓｔｒａｉｎ邋ＰＣ－４邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅ逡逑２．３．４．２光學及掃描顯微鏡觀察結(jié)果逡逑通過光學顯微鏡和掃描電鏡觀察，菌絲為有隔菌絲，該菌株的分生孢子有兩種類逡逑型：一種比較大，孢子呈紡錘形或鐮刀形，大小為（１５￣２５）邋｜Ｌｉｍ邋ｘ邋（３￣５）邋（ｉｍ，有逡逑１６逡逑

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本文編號：2834645