植物在生長發(fā)育過程中很容易受到周圍環(huán)境的影響,由病原體灰霉菌(Botrytis cinerea)引起的番茄灰霉病是危害番茄生產的主要因素之一。根據課題組前期的研究結果顯示,miR394響應灰霉菌的感染。本研究利用過表達miR394的轉基因擬南芥和lcr突變株擬南芥,進一步明確了miR394在番茄防御灰霉病過程中的功能及其作用機制,主要研究結果如下:1、用灰霉菌處理Micro-Tom番茄,在不同時間點進行樣品采集,qRT-PCR結果表明,miR394參與植物對灰霉菌的防御。2、為了進一步確定miR394的功能作用,我們將過表達miR394的轉基因及其靶基因lcr的突變株擬南芥接種灰霉菌。發(fā)現與野生型相比,過表達miR394的轉基因擬南芥和lcr突變株擬南芥的葉片表面均出現較大的病變面積,且綜合臺盼藍染色的結果,說明擬南芥miR394通過直接作用于靶基因LCR作為擬南芥防御灰霉菌感染的負調節(jié)劑,使得植物對灰霉菌更加敏感。3、轉基因株系中miR394的過表達對其它脅迫相關miRNAs產生影響。利用qPCR檢測結果顯示除miR159以外,miR156、miR168以及miR172的表達水平在各個株系中均上調,表明這些miRNAs與miR394存在潛在聯(lián)系。4、對mi RNA合成和作用過程中的7個相關蛋白基因在轉基因株系中進行表達檢測,其中DDL、DRB4和AGO1共3個基因的表達上調,說明miR394的過表達對這些基因具有正反饋作用。5、植物中的兩條激素調節(jié)途徑:茉莉酸及水楊酸途徑中的4個關鍵基因在過表達miR394的轉基因植株和lcr突變株中被檢測,高水平的miR394或低水平的LCR均導致PDF1.2(Plant Defensin1.2)和PR4(Pathogenesis-Related protein 4)表達量的增加,這可能也作為一種潛在的影響因素,使得miR394/LCR對灰霉菌感染的敏感性增強。6、已有相關報道揭示mi R394參與植物的非生物脅迫應答,我們對此進行了驗證,并得到一致的結果,說明mi R394的過表達使得擬南芥耐旱而不耐鹽。本研究探討了miR394/LCR在擬南芥抵抗灰霉菌中的作用,明確了miR394/LCR在應答灰霉菌時可能協(xié)同JA/SA途徑的相關基因。這些研究將為進一步明確miR394/LCR的調控機制和灰霉菌的分子防治提供技術依據。
【學位單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S436.412
【部分圖文】：

堿基切割以產生pre-miRNA發(fā)夾結構，并再次剪切生成miRNA/miRNA*雙鏈，DCL1 催化的第一次切割雖然遵循“l(fā)oop-last”，但 miR319 獨特且精密的“l(fā)oop-first”加工模式存在于天然的小立碗蘚，水稻和擬南芥，甚至基于擬南芥 miR319的骨架來構建人工 miRNA（artificial MIRNA， aMIRNA）[18, 21, 41-43]。大多數植物 pri-miRNA 發(fā)夾產生單個 miRNA / miRNA*雙鏈體，但是一些基因座（包括MIR159 和 MIR319）始終產生多個雙鏈體[21,41,42,44]。植物 miRNA 的生物合成在細胞核內完成，在特定的亞核區(qū)域被稱為 D-body[45-47]。最初的 miRNA / miRNA*雙鏈體的 3' 核苷酸需要被核 HEN1 蛋白質 2' -O-甲基化[48-50]。2'-O-甲基化標記可以防止 miRNA 免受 3' 末端尿苷化和 3'→5' 外切核酸降解[49, 51]。在植物中，HASTY作為一種動物Exportin-5轉運蛋白的同系物，被認為是將miRNA/miRNA*雙鏈體運輸到細胞質 AGO 蛋白中，其中 AGO1 是植物 miRNA 的主要載體[52,53]。在擬南芥中 AGO1 蛋白可使用固有的 RNaseH-like 活性來切割（“slicer”）靶標 mRNA，其它大多數植物 AGOs 也可能擁有切片功能[21, 54, 55]。

第三章 實驗結果1. MiR394 在番茄和擬南芥中的組織特異性表達1.1 MiR394 及其初級轉錄本在番茄不同組織中的表達我們希望對 miR394 的功能進行更深層次的分析，但是發(fā)現 miR394 在番中有兩種存在形式 miR394-5p 和 miR394-3p（miR394*），因此我們對 miR394 組織表達特異性進行了研究。使用 qPCR 在以下四種番茄組織：莖、葉、花和實中檢測了兩種成熟 miRNAs 及其初級轉錄本的表達水平。結果顯示兩miR394 及 pri-miR394 均存在于以上四種組織中，但在各個組織中表達水平有不同。Pri-miR394 的水平在果實中最低，莖中最高，葉和花中的表達水平居中（2A）。MiR394-5p 在花中最低，莖中最高，葉和果實居中（圖 2B）。而 miR393p 的水平在莖中最低，花中最高，在葉和果實居中（圖 2B）。與 miR394-5p 比，除了花以外，在番茄另外三個組織中 miR394-3p 的表達水平顯著降低（2B）。因此，綜合以上結果我們選擇了 miR394-5p 用于后續(xù)的實驗研究中。

4-5p 和 miR394-3p 在 4 個擬南芥組織中ion levels in 4 Arabidopsis tissues betwe3p的侵染錄本在接種灰霉菌的番茄葉片中 在接種了灰霉菌的番茄葉片中的應 miR394 及其初級轉錄本 pri-miR的番茄中，miR394 的表達沒有顯番茄品種 Micro-Tom 葉片中，不同之前在接種灰霉菌的番茄品種金棚結果[94]。其中 pri-miR394 除在接其它時間點都有所下降（圖 3C）。達量確實有所變化，說明 miR394

【參考文獻】

相關期刊論文 前7條

1 汪學軍;閔長莉;楊艷;;堆肥放線菌DF02分離及對番茄灰霉病生防作用[J];中藥材;2015年08期

2 李夢莎;閻秀峰;;植物的環(huán)境信號分子茉莉酸及其生物學功能[J];生態(tài)學報;2014年23期

3 趙紅霞;茍萍;;灰葡萄孢菌致病機理研究進展[J];生物技術;2014年01期

4 孫健健;;灰霉病的微生物防治研究進展[J];天津化工;2012年04期

5 陳鳳平;韓平;張真真;劉君麗;劉西莉;;啶菌VA唑對番茄灰霉病菌的抑菌作用研究[J];農藥學學報;2010年01期

6 張智,李君明,宋燕,云興福,徐和金,周永健;番茄灰霉病及其防治研究進展[J];內蒙古農業(yè)大學學報(自然科學版);2005年02期

7 王漢榮,茹水江,王連平,金立新,陳春華,吳通興,何紅衛(wèi);不同藥劑及施藥方法對番茄灰霉病的防治效果[J];中國農學通報;2003年06期

本文編號：2830093