植物在生長發(fā)育過程中很容易受到周圍環(huán)境的影響,由病原體灰霉菌(Botrytis cinerea)引起的番茄灰霉病是危害番茄生產(chǎn)的主要因素之一。根據(jù)課題組前期的研究結(jié)果顯示,miR394響應(yīng)灰霉菌的感染。本研究利用過表達(dá)miR394的轉(zhuǎn)基因擬南芥和lcr突變株擬南芥,進(jìn)一步明確了miR394在番茄防御灰霉病過程中的功能及其作用機(jī)制,主要研究結(jié)果如下:1、用灰霉菌處理Micro-Tom番茄,在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行樣品采集,qRT-PCR結(jié)果表明,miR394參與植物對(duì)灰霉菌的防御。2、為了進(jìn)一步確定miR394的功能作用,我們將過表達(dá)miR394的轉(zhuǎn)基因及其靶基因lcr的突變株擬南芥接種灰霉菌。發(fā)現(xiàn)與野生型相比,過表達(dá)miR394的轉(zhuǎn)基因擬南芥和lcr突變株擬南芥的葉片表面均出現(xiàn)較大的病變面積,且綜合臺(tái)盼藍(lán)染色的結(jié)果,說明擬南芥miR394通過直接作用于靶基因LCR作為擬南芥防御灰霉菌感染的負(fù)調(diào)節(jié)劑,使得植物對(duì)灰霉菌更加敏感。3、轉(zhuǎn)基因株系中miR394的過表達(dá)對(duì)其它脅迫相關(guān)miRNAs產(chǎn)生影響。利用qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示除miR159以外,miR156、miR168以及miR172的表達(dá)水平在各個(gè)株系中均上調(diào),表明這些miRNAs與miR394存在潛在聯(lián)系。4、對(duì)mi RNA合成和作用過程中的7個(gè)相關(guān)蛋白基因在轉(zhuǎn)基因株系中進(jìn)行表達(dá)檢測(cè),其中DDL、DRB4和AGO1共3個(gè)基因的表達(dá)上調(diào),說明miR394的過表達(dá)對(duì)這些基因具有正反饋?zhàn)饔谩?、植物中的兩條激素調(diào)節(jié)途徑:茉莉酸及水楊酸途徑中的4個(gè)關(guān)鍵基因在過表達(dá)miR394的轉(zhuǎn)基因植株和lcr突變株中被檢測(cè),高水平的miR394或低水平的LCR均導(dǎo)致PDF1.2(Plant Defensin1.2)和PR4(Pathogenesis-Related protein 4)表達(dá)量的增加,這可能也作為一種潛在的影響因素,使得miR394/LCR對(duì)灰霉菌感染的敏感性增強(qiáng)。6、已有相關(guān)報(bào)道揭示mi R394參與植物的非生物脅迫應(yīng)答,我們對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證,并得到一致的結(jié)果,說明mi R394的過表達(dá)使得擬南芥耐旱而不耐鹽。本研究探討了miR394/LCR在擬南芥抵抗灰霉菌中的作用,明確了miR394/LCR在應(yīng)答灰霉菌時(shí)可能協(xié)同JA/SA途徑的相關(guān)基因。這些研究將為進(jìn)一步明確miR394/LCR的調(diào)控機(jī)制和灰霉菌的分子防治提供技術(shù)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S436.412
【部分圖文】：

堿基切割以產(chǎn)生pre-miRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并再次剪切生成miRNA/miRNA*雙鏈，DCL1 催化的第一次切割雖然遵循“l(fā)oop-last”，但 miR319 獨(dú)特且精密的“l(fā)oop-first”加工模式存在于天然的小立碗蘚，水稻和擬南芥，甚至基于擬南芥 miR319的骨架來構(gòu)建人工 miRNA（artificial MIRNA， aMIRNA）[18, 21, 41-43]。大多數(shù)植物 pri-miRNA 發(fā)夾產(chǎn)生單個(gè) miRNA / miRNA*雙鏈體，但是一些基因座（包括MIR159 和 MIR319）始終產(chǎn)生多個(gè)雙鏈體[21,41,42,44]。植物 miRNA 的生物合成在細(xì)胞核內(nèi)完成，在特定的亞核區(qū)域被稱為 D-body[45-47]。最初的 miRNA / miRNA*雙鏈體的 3' 核苷酸需要被核 HEN1 蛋白質(zhì) 2' -O-甲基化[48-50]。2'-O-甲基化標(biāo)記可以防止 miRNA 免受 3' 末端尿苷化和 3'→5' 外切核酸降解[49, 51]。在植物中，HASTY作為一種動(dòng)物Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的同系物，被認(rèn)為是將miRNA/miRNA*雙鏈體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì) AGO 蛋白中，其中 AGO1 是植物 miRNA 的主要載體[52,53]。在擬南芥中 AGO1 蛋白可使用固有的 RNaseH-like 活性來切割（“slicer”）靶標(biāo) mRNA，其它大多數(shù)植物 AGOs 也可能擁有切片功能[21, 54, 55]。

第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. MiR394 在番茄和擬南芥中的組織特異性表達(dá)1.1 MiR394 及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄本在番茄不同組織中的表達(dá)我們希望對(duì) miR394 的功能進(jìn)行更深層次的分析，但是發(fā)現(xiàn) miR394 在番中有兩種存在形式 miR394-5p 和 miR394-3p（miR394*），因此我們對(duì) miR394 組織表達(dá)特異性進(jìn)行了研究。使用 qPCR 在以下四種番茄組織：莖、葉、花和實(shí)中檢測(cè)了兩種成熟 miRNAs 及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。結(jié)果顯示兩miR394 及 pri-miR394 均存在于以上四種組織中，但在各個(gè)組織中表達(dá)水平有不同。Pri-miR394 的水平在果實(shí)中最低，莖中最高，葉和花中的表達(dá)水平居中（2A）。MiR394-5p 在花中最低，莖中最高，葉和果實(shí)居中（圖 2B）。而 miR393p 的水平在莖中最低，花中最高，在葉和果實(shí)居中（圖 2B）。與 miR394-5p 比，除了花以外，在番茄另外三個(gè)組織中 miR394-3p 的表達(dá)水平顯著降低（2B）。因此，綜合以上結(jié)果我們選擇了 miR394-5p 用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究中。

4-5p 和 miR394-3p 在 4 個(gè)擬南芥組織中ion levels in 4 Arabidopsis tissues betwe3p的侵染錄本在接種灰霉菌的番茄葉片中 在接種了灰霉菌的番茄葉片中的應(yīng) miR394 及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄本 pri-miR的番茄中，miR394 的表達(dá)沒有顯番茄品種 Micro-Tom 葉片中，不同之前在接種灰霉菌的番茄品種金棚結(jié)果[94]。其中 pri-miR394 除在接其它時(shí)間點(diǎn)都有所下降（圖 3C）。達(dá)量確實(shí)有所變化，說明 miR394

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號(hào)：2830093