由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani kuhn)引起的水稻紋枯病(Rice sheath blight)是水稻三大病害之一,該病害會造成嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)損失和經(jīng)濟損失。目前,雖然已經(jīng)確定了一些功能性基因參與了水稻紋枯病的抗病過程,但沒有發(fā)現(xiàn)完全抗病的水稻品種或免疫品種,因此對該病的治理方法仍以農(nóng)藥防治為主。盡管水稻紋枯病的危害嚴(yán)重,但對抗性的研究進展緩慢,部分原因是由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)的抗性鑒定方法,且該病很容易受到小規(guī)模農(nóng)田的田間條件的影響�；谶@種現(xiàn)狀,開展水稻抵抗紋枯病菌防御反應(yīng)的分子機制研究,既可獲得更多的抗性種質(zhì)資源,又為分子育種、提高水稻產(chǎn)量和改善稻米品質(zhì)提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。1.水稻miRNA對立枯絲核菌侵染的應(yīng)答反應(yīng)本研究利用水稻紋枯病病原菌R.solani(YN-7),對感病品種徐稻3號和抗病品種YSBR1兩種不同抗性的水稻進行侵染,構(gòu)建了 3個不同侵染時間點共計12個小RNA文庫:水處理Xudao3命名為XC5、XC10和XC20,R.solani處理Xudao3 命名為 XT5、XT10 和 XT20;水處理 YSBR1 命名為 YC5、YC10 和 YC20,R.solani處理YSBR1命名為YT5、YT10和YT20。(1)通過生物信息學(xué)對sRNA-seq數(shù)據(jù)進行分析,結(jié)果表明,在測試的水稻品種中存在復(fù)雜多樣的miRNA群體,從而為發(fā)現(xiàn)水稻中植物-病原體相互作用的分子基礎(chǔ)提供了有意義的數(shù)據(jù)庫。(2)綜合Northern Blot和qRT-PCR分析,進一步驗證4種已知的miRNA(miR444b.2、miR531a、miR535-3p 和 miR166i-3p)和 2 種未知的 miRNA(novel_miR1956 和novel_miR135)。(3)通過生物信息學(xué)預(yù)測這些miRNA的靶基因,并通過煙草共表達實驗,證實了 miR535-3p和miR166i-3p分別在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控LOC_Os04g16540 和 LOC_Os11g07270 的表達。(4)構(gòu)建 miRNA 及其靶基因的敲除和過表達載體,進行轉(zhuǎn)基因水稻的表型分析,結(jié)果表明,過表達miR535-3p和miR444b.2能提高水稻對紋枯病的抗性,并在株高、穗長及千粒重等方面改變了水稻的農(nóng)業(yè)性狀。綜上所述,本研究通過RNA-seq的方法,挖掘出一些可能參與水稻抗紋枯病過程的重要miRNA,其具體功能及分子機理將是本研究進一步深入研究的方向,為防治水稻紋枯病提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)。2.水稻紋枯病的早期快速檢測(1)基于立枯絲核菌基因組ITS區(qū)設(shè)計了一對針對病原菌的特異性引物,特異性檢測結(jié)果準(zhǔn)確。(2)使用優(yōu)化的Quantitative PCR(qPCR)體系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,檢測待測樣品。標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)R2為0.9963,完全適用于對該菌的定量檢測,且比常規(guī)PCR靈敏度高出10000倍,結(jié)果穩(wěn)定可靠。(3)使用R.solani菌株YN-7對五種不同抗性的水稻進行侵染,分別在2hpi,5hpi,8hpi,10hpi和20 hpi的時間點取樣并提取水稻基因組DNA。病原菌菌絲棉蘭染色組織檢查結(jié)果與qPCR生物量富集結(jié)果一致,表明R.solani侵染水稻10小時后能被準(zhǔn)確檢測出來,說明本研究建立的快速檢測水稻紋枯病發(fā)病的方法在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具備實用性和可推廣性。該方法特異性強、靈敏度高、檢測迅速,能很好地用于水稻紋枯病菌生物量的定量檢測,對掌握病害發(fā)生發(fā)展及流行以及指導(dǎo)病害預(yù)測預(yù)報具有重要意義。
【學(xué)位單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S435.111.42
【部分圖文】：

２．１．１邐Ｘｕｄａｏ３和ＹＳＢＲ１的接種后表型逡逑抗性品種ＹＳＢＲ１和感病品種Ｘｕｄａｏ３均用兄．ｗ／ａｍ？分離株ＹＮ－７的菌絲體定逡逑殖的火柴梗接種（圖２－２Ａ－Ｂ）。在接種后１０ｈｐｉ，顯微鏡組織棉蘭染色觀察到逡逑ＹＮ－７的轉(zhuǎn)輪菌絲沿著兩個品種的表皮細胞的連接處生長（圖２－２邋Ｃ和Ｆ）。發(fā)現(xiàn)逡逑兩個栽培品種的葉鞘變黃并在２０邋ｈｐｉ時呈現(xiàn)水漬狀病斑（圖２－２邋Ｄ和Ｇ）。在至逡逑少２０個單獨的水稻幼苗上類似地觀察到這些結(jié)果，這表明在接種后一天（ｄｐｉ）逡逑之前兩個栽培種之間的表型相似（圖２－２（：－０，？－０）。同時，在２0＾時，丫５８１１１逡逑的病斑長度比Ｘｕｄａｏ３的病斑長度短，并且在２邋ｄｐｉ后隨著時間的增加，差異變逡逑得越來越明顯。我們的研宄結(jié)果表明，ＹＳＢＲ１對兄—的抗性顯著強于Ｘｕｄａｏ３逡逑（圖邋２－２Ｅ，Ｈ，Ｉ）。逡逑

邋ｓｎＲＮＡ，ｓｎｏＲＮＡ和ｔＲＮＡ�？偠灾�，這結(jié)果顯示我們的ｓＲＮＡ文庫在逡逑ｍｉＲＮＡ中高度富集。對讀數(shù)分布，大部分讀數(shù)來自２號染色體和９號染色體，逡逑并且在這些讀數(shù)中，超過９０％的讀數(shù)從感應(yīng)株轉(zhuǎn)錄（圖２－４邋Ａ）。所有ｓＲＮＡ的逡逑長度范圍從１８至３０ｎｔ。在所有大小類別中，２１和２４ｎｔ的ｓＲＮＡ種類是兩個最豐逡逑富的類別（圖２－４邋Ｂ）。在ｍｉＲＮＡ序列群中，超過９５％的序列首個堿基為尿嘧逡逑唳（圖２－４Ｃ）。研究表明，Ａｒｇｏｎｕａｔｅ蛋白質(zhì)基于５’末端核苷酸的差異識別不同逡逑ｓＲＮＡ，例如，ＡＧ０１和ＡＧ０５募集具有５’末端尿嘧啶（Ｕ）和胞嘧啶（Ｃ）的逡逑ｓＲＮＡ，而ＡＧ０２和ＡＧ０４分別募集具有５’末端腺苷（Ａ）的ｓＲＮＡ［＿６］。逡逑Ａ逡逑１．８０Ｅ＋０８逡逑■邋Ｓｅｎｓｅ邋■邋Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ逡逑１．６０Ｅ＋０８邐邐邋邐逡逑Ｌ４０Ｅ＋０８逡逑｜邐１．２０Ｅ＋０８逡逑ｕ逡逑Ｓ邋１．００Ｅ＊０８逡逑蘭邋３．００Ｅ＊０７逡逑６．００Ｅ＾０７邐■逡逑Ｅｌ邋Ｉｌｉｉｉｌ邋ｌｉｌ．：逡逑＜／■邋ｃ／＂邋＜５？邐＜５？逡逑Ｄ邐Ｃ

因與分子功能中的細胞和細胞成分類別相關(guān)，分別在Ｘｕｄａｏ３和ＹＳＢＲ１中分配逡逑了近３００和４００個分子功能基因。對于細胞成分類別，結(jié)合和催化活性分別與逡逑Ｘｕｄａｏ３和ＹＳＢＲ１中的１００和２００個轉(zhuǎn)錄物相關(guān)（圖２－８）。逡逑－邋ＹＳＢＲ１邐門邐邐邋邐逡逑Ｉ？逡逑ｉ邋—邐Ｉ邐ｉ逡逑．．邋Ｉｌｌ邋Ｉ？ｉ邋ｉｌｌ邐Ｉｌｌ邋Ｉ邋ｉ－Ｋ邋��？＜邋Ｉｃ＊邋ｌ邋ＩＩＩ邋Ｇｉｌ邋．．．．邋■．．？邋＿＿逡逑？，邋Ｘｕｄａｏ３逡逑ｉ－逡逑譽一邐＊逡逑ｒO嗗義希恚恚礤�？e歟危螅櫻翦澹齲濉鰣澹懾澹危眨停礤澹恚梗礤澹螅椋戾�？邋■■埩x�？ｉ逦劐劐ｉ逦匚匚１邋１１１１逦１１逦１逦！逦澄１逦！逦匚１逦１逦澄－ｔ！逦：ｔ邋ｑw危海翦義希翦危歟椋殄危殄危懾危殄澹殄

本文編號：2829996