稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是一類絲狀子囊真菌,主要通過無性態(tài)孢子進行傳播。目前,該病菌已成為影響全球水稻產(chǎn)量最為嚴重的病原微生物之一。利用分子生物學和遺傳學等方法揭示稻瘟病菌的侵染機理,鑒定致病相關蛋白,可為該病菌高效低毒農(nóng)藥靶標的研發(fā)提供有效參考。真核生物中蛋白質(zhì)的翻譯后異戊烯化修飾(CAAX修飾)能夠介導包括小G蛋白、核纖層蛋白等重要蛋白質(zhì)的亞細胞定位以及蛋白與蛋白間的相互作用。為探究稻瘟病菌中的異戊烯修飾是否在其生長發(fā)育和致病性中發(fā)揮功能,本實驗對稻瘟病菌中的MoSte24以及MoRce1兩個異戊烯蛋白酶展開研究,并初步建立稻瘟病菌中異戊烯蛋白酶與其修飾底物間的聯(lián)系,實驗主要得出以下結(jié)論:根據(jù)真菌數(shù)據(jù)庫同源比對釀酒酵母中的異戊烯蛋白酶,獲得稻瘟病菌中的兩個異戊烯蛋白酶MoSte24和MoRce1。從結(jié)構域預測分析的結(jié)果來看,兩類蛋白都呈現(xiàn)出多個跨膜結(jié)構域,暗示其可能皆為膜整合蛋白;通過實時熒光定量PCR檢測MoSTE24與MoRCE1在稻瘟病菌營養(yǎng)菌絲階段以及侵染菌絲階段的表達情況發(fā)現(xiàn),MoSTE24在稻瘟病菌的侵染前期階段呈現(xiàn)出顯著上調(diào)表達的趨勢,而MoRCE1在侵染不同階段的表達水平相較于營養(yǎng)菌絲階段都未呈現(xiàn)出明顯的變化;蛋白定位預測以及亞細胞定位的實驗結(jié)果表明MoSte24定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,而MoRce1可能主要定位于質(zhì)膜區(qū)域;在稻瘟病菌中敲除MoSTE24與MoRCE1后對其突變體的表型分析發(fā)現(xiàn),MoRCE1的缺失突變體ΔMorce1在脅迫培養(yǎng)的實驗中呈現(xiàn)出了細胞壁完整性缺陷的表型;MoSTE24的缺失突變體ΔMoste24在侵染寄主的過程中,其侵染菌絲的擴展能力顯著下降,表現(xiàn)為致病能力的顯著減弱;進一步在對野生型Guy11與ΔMoste24中的異戊烯修飾底物MoRho3進行定位分析可以看出,野生型Guy11中MoRho3主要定位于質(zhì)膜區(qū)域,在ΔMoste24中MoRho3則主要分布在細胞質(zhì)中,說明MoSTE24的功能缺失影響了MoRho3的正確定位,即MoRho3可能是MoSte24修飾的底物之一。實驗結(jié)果表明,稻瘟病菌中的異戊烯蛋白酶MoSte24與MoRce1具有不同的定位模式,并且這兩類蛋白存在功能分化,其中MoRce1可能參與修飾稻瘟病菌細胞壁合成相關的蛋白,而MoSte24在侵染寄主前期大量表達并可能通過修飾MoRho3等一些致病相關蛋白來間接調(diào)控稻瘟病的致病能力。
【學位單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S435.111.41
【部分圖文】：

圖 1-1 稻瘟病菌的循環(huán)生活史Fig.1-1 The life cycle of M.oryzae[10]2 Small GTPases 及其翻譯后脂修飾的生物學意義2.1 Small GTPasesSmall GTPases 即小分子量（20-30 kDa）的 GTP 結(jié)合蛋白，又稱小 G小 G 蛋白，其自身具有 GTP 酶活性，是 Ras GTPase 超家族中的成員，類古老的分子開關，它的功能涉及到動植物生命活動的廣泛領域[11]。Small GTPases 中存在與 GTP 結(jié)合的激活態(tài)和 GDP 結(jié)合的失活態(tài)，這的分子模式使其成為能夠偶聯(lián)胞外信號和胞內(nèi)信號網(wǎng)絡的分子開關，并以包括增殖、分化、凋亡、極性形成等廣泛的細胞生命活動[12]。此外，Pases 的兩種狀態(tài)同時還受到兩類蛋白的調(diào)控，即鳥苷酸交換因子（GEFP 酶激活蛋白（GAPs），前者能促進 Small GTPases 從失活態(tài)轉(zhuǎn)化為 GTP

圖 1-2 Small GTPases 的活性循環(huán)過程Fig.1-2 The Small GTPase cycleGEFs promote the activation of small GTPases, while GAPs helpolyze GTP to inactive small GTPases, GDI can sequester GDP-bouGTPases 的結(jié)構ase 超家族的 Small GTPases 持有一個 GTP 結(jié)合核心和其在序列和功能上存在較大差異。實際上，它們在 N 末xes”（G1 至 G5）的典型保守基序，并且伴有五個 α 螺B1-B6）， 它們共同構成了 20kDa 的“G 結(jié)構域”，鳥解過程便是通過該結(jié)構域?qū)崿F(xiàn)的[12, 16]。相關研究表明s 共享使用不同種類的的鳥嘌呤核苷酸交換因子和 GT同分支的 SmallGTPases 發(fā)現(xiàn)，GEFs 和 GAPs 呈現(xiàn)出顯機理上卻十分相似[17]。同物種的 RasGTPase 超家族序列比對分析顯示，它們

1 引言戊烯化的 Cys 位點由異戊烯半胱氨酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶（ICMT，酵母中為 Ste14）進行甲基化修飾[37]。這些最初集中于 CAAX 基序的翻譯后脂修飾過程使得小GTP 酶對細胞膜具有了一定的結(jié)合能力，但有時還需要額外的“第二信號”促進質(zhì)膜結(jié)合，以 H-Ras 蛋白為例，由于其 CAAX 基序毗鄰的 Cys 殘基參與了棕櫚�；揎�，因此進一步加強了自身與質(zhì)膜結(jié)合的穩(wěn)定性[41]。異戊烯化為蛋白質(zhì)提供的這些疏水性末端，其直接結(jié)果是被修飾蛋白與特定細胞膜相互作用的能力大大增加，同時，異戊烯化的基序、獨特的 CAAX 蛋白序列和結(jié)構決定了蛋白質(zhì)質(zhì)膜、內(nèi)膜或特定的胞質(zhì)區(qū)域定位的多樣性[42]。蛋白質(zhì)C 末端的修飾除了將蛋白質(zhì)定位于細胞的不同區(qū)域外，還影響了它們的諸多功能，包括促進特定的蛋白—蛋白相互作用、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性以及在各種疾病過程中發(fā)揮特定功能[43, 44]。

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 任力強;;蛋白質(zhì)異戊二烯化修飾作用的研究進展[J];國外醫(yī)學(分子生物學分冊);1993年04期

本文編號：2827197