蘋果蠹蛾Cydia pomonella L.(鱗翅目,卷蛾科)是世界上最重要的果樹害蟲之一,也是我國(guó)重要檢疫有害生物。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferases,GSTs)酶活性的升高是蘋果蠹蛾對(duì)多種殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的主要機(jī)制。Delta和Epsilon家族GSTs基因主要參與昆蟲對(duì)化學(xué)殺蟲劑的解毒代謝和抗藥性的形成。然而,蘋果蠹蛾Delta和Epsilon家族GSTs基因的鑒定及對(duì)化學(xué)殺蟲劑代謝作用的研究尚不系統(tǒng)和深入。鑒定蘋果蠹蛾Delta和Epsilon家族GSTs基因并解析其對(duì)化學(xué)殺蟲劑的代謝功能,對(duì)揭示GSTs介導(dǎo)的代謝抗性機(jī)制具有重要意義。本文從蘋果蠹蛾轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出所有的Delta和Epsilon家族GSTs基因,并對(duì)它們的時(shí)空表達(dá)模式和殺蟲劑脅迫后的表達(dá)模式進(jìn)行了研究;在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了部分GSTs重組蛋白,并測(cè)定了體外酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)和殺蟲劑對(duì)重組蛋白CpGSTd3的抑制活性;通過體外代謝試驗(yàn),證實(shí)了CpGSTd3可以代謝高效氯氟氰菊酯。主要研究結(jié)果如下:1.蘋果蠹蛾GSTs基因的鑒定通過對(duì)蘋果蠹蛾轉(zhuǎn)錄組和基因組的篩查,共鑒定出29個(gè)GSTs基因,其中胞質(zhì)型GSTs基因26個(gè),微粒體型GSTs基因3個(gè)。在胞質(zhì)型GSTs基因中,包含Delta家族4個(gè),Epsilon家族5個(gè),Zeta家族GSTs基因2個(gè),Theta家族GSTs基因1個(gè),Sigma家族GSTs基因5個(gè),Omega家族GSTs基因3個(gè),未分類GSTs基因6個(gè)。其中,Delta和Epsilon家族GSTs基因與近緣昆蟲GSTs基因的氨基酸序列一致性分別為42.79-58.80%和31.90-41.12%。2.蘋果蠹蛾Delta和Epsilon家族GSTs基因的表達(dá)模式分析利用熒光定量PCR(RT-qPCR)對(duì)蘋果蠹蛾Delta家族和Epsilon家族GSTs基因在不同發(fā)育階段、幼蟲的不同組織和高效氯氟氰菊酯脅迫后的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明,這些GSTs基因在蘋果蠹蛾的各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá),其中CpGSTd3、CpGSTe2、CpGSTe3和CpGSTe4主要在幼蟲期表達(dá);CpGSTd2、CpGSTd4、CpGSTe1和CpGSTe5基因表達(dá)量在雌雄性別間存在明顯差異。這些GSTs基因主要在中腸、馬氏管和脂肪體等解毒器官中表達(dá),CpGSTd3在脂肪體中不表達(dá)。LD_(10)高效氯氟氰菊酯脅迫后,幼蟲體內(nèi)GSTs基因的表達(dá)水平在不同脅迫時(shí)長(zhǎng)下呈現(xiàn)出現(xiàn)上升后下降的現(xiàn)象,僅CpGSTd4和CpGSTe1這兩個(gè)基因的表達(dá)水平與之相反。3.蘋果蠹蛾Delta和Epsilon家族GSTs蛋白的體外表達(dá)及功能分析利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)并純化了CpGSTd3、CpGSTd4、CpGSTe2和CpGSTe3重組蛋白。這幾個(gè)重組表達(dá)蛋白的最大反應(yīng)速率(V_(max))值分別為13.11±0.68μmol/min/mg、1.55±0.11μmol/min/mg、9.71±0.18μmol/min/mg和12.45±0.80μmol/min/mg,米氏常數(shù)(K_m)分別為0.63±0.09 mM、0.67±0.12 mM、0.09±0.01 mM和0.31±0.06 mM。體外抑制試驗(yàn)結(jié)果表明,高效氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、醚菊酯、毒死蜱和辛硫磷均可抑制CpGSTd3重組表達(dá)酶的活性,其IC_(50)值分別為0.65、0.48、0.29、0.19和0.53mM。體外代謝結(jié)果表明,CpGSTd3重組蛋白可以代謝高效氯氟氰菊酯。
【學(xué)位單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S433.4
【部分圖文】：

圖 1-1 蘋果蠹蛾在中國(guó)的 3 個(gè)擴(kuò)散階段及在不同地區(qū)的具體擴(kuò)散路線（徐婧等，2015）ig. 1-1 Illustration of the 3 stages of dispersal for C. pomonella in China and their dispersal routes into different regions (figure adapted from Xu et al., 2015). 擴(kuò)散階段與路線，第一階段為 1987 年之前，第二階段為 1987 至 2006 年，第三階段為 2006 年至今；B. 新疆；甘肅、內(nèi)蒙古及寧夏；D. 遼寧、吉林及黑龍江. Expansion stages and routs，stage 1 is before 1987，stage 2 is 1978 to 2006，stage 3 is from 2006 to now; B. XinjiangGansu，Inner Mongolia and Ningxia; D. Liaoning，Jilin and Heilongjiang.1.2 蘋果蠹蛾的生物學(xué)特征在我國(guó)，蘋果蠹蛾一年可發(fā)生 2-3 代，但該蟲存在明顯的世代重疊現(xiàn)象（De Waal.，2010）。蘋果蠹蛾以老熟幼蟲在樹皮下或地表土層內(nèi)越冬，羿年四月中旬左右開蛹，5 月下旬到 6 月上旬為 1 代幼蟲孵化盛期，7 月下旬到 8 月上旬為 2 代幼蟲孵期，9 月上旬到下旬間開始陸續(xù)滯育越冬（翟小偉，2009）。蘋果蠹蛾成蟲在夜間產(chǎn)卵，產(chǎn)卵后的 5-10 天幼蟲開始孵化。幼蟲的整個(gè)階段幾乎都在果實(shí)內(nèi)，如果果

圖 1-2 蘋果蠹蛾幼蟲危害狀Fig. 1-2 The hazard symptom by C. pomonella蘋果蠹蛾的綜合防控蠹蛾的防控十分困難，其原因包括：寄主范圍廣、存在世代重習(xí)性等。在蘋果蠹蛾的疫區(qū)應(yīng)著力開展鏟除措施，而在非疫區(qū)則蘋果蠹蛾的綜合防控措施包括以下幾部分：，植物檢疫。蘋果蠹蛾的自身擴(kuò)散能力有限，傳播擴(kuò)散主要是敏等，2015）。因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)疫區(qū)調(diào)運(yùn)果品的檢疫工作，一旦發(fā)，來自疫區(qū)的包裝材料和集裝箱等也要嚴(yán)格檢查，如果發(fā)現(xiàn)疫情采取檢疫處理措施。，農(nóng)業(yè)防治。在蘋果蠹蛾的發(fā)生區(qū)，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)果園的清潔和管蛀果和地面上的落果，深埋或集中銷毀。根據(jù)蘋果蠹蛾多在樹干或春季，人工刮除果樹主干與主枝基部的老翹皮進(jìn)行集中焚燒，

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文11 CpGSTz2 Zeta MG100870 26 GST like-4 未分類 MG10087412 CpGSTt1 Theta KX500036 27 CpGSTm1 微粒體型 KX50004113 CpGSTs1 Sigma KX500037 28 CpGSRm2 微粒體型 KX50004214 CpGSTs2 Sigma MG100868 29 CpGSTm3 微粒體型 MG10087715 CpGSTs3 Sigma MG100873.2.2 基因組中鑒定蘋果蠹蛾 Delta 和 Epsilon 家族 GSTs 基因在這 9 個(gè) ORF 完整的 Delta 和 Epsilon 家族蘋果蠹蛾 GSTs 基因中，僅有一個(gè)基CpGSTe1）沒有在基因組中查找到其所在位置，其余 8 個(gè)蘋果蠹蛾 GSTs 基因均發(fā)所在基因位置（圖 2-1）。而這 8 個(gè)蘋果蠹蛾 GSTs 基因中的外顯子數(shù)目較類似，個(gè) 4 到 6 個(gè)不等。

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本文編號(hào)：2826795