柑橘黃化脈明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV),隸屬于甲型線狀病毒科Alphaflexiviridae印度柑橘病毒屬M(fèi)andarivirus,該病毒主要侵染檸檬、甜橙、酸橙、葡萄柚等常見柑橘寄主。自2014年我國首次報(bào)道該病毒發(fā)生以來,由CYVCV引起的柑橘黃化脈明病已在多個(gè)地區(qū)爆發(fā)成災(zāi),病害發(fā)生呈上升的趨勢。明確我國CYVCV的遺傳變異情況,可為了解CYVCV致病性及其流行發(fā)生規(guī)律提供更好的依據(jù),對于制定CYVCV的有效防控措施,防止CYVCV在我國大發(fā)生具有重要意義。本研究從四川、湖北、廣西和云南4個(gè)省份共采集了86份疑似柑橘黃化脈明病樣品,利用CYVCV特異性引物對其進(jìn)行了RT-PCR檢測。結(jié)果表明,在86份CYVCV田間疑似樣品中有56份樣品均檢測到CYVCV,總檢出率為65.12%。統(tǒng)計(jì)不同寄主樣品中CYVCV的檢出率發(fā)現(xiàn),在檸檬樣品中CYVCV的檢出率最高,達(dá)83.33%;柚子中CYVCV的檢出率最低,為16.67%。對不同地理來源的樣品檢出情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),各地區(qū)樣品中CYVCV的檢出率有一定差異性,其中湖北樣品檢出率最高,達(dá)100%,云南樣品檢出率最低,為43.48%。另外,廣西地區(qū)樣品與其它地區(qū)的樣品相比而言癥狀表現(xiàn)較復(fù)雜,對比檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),在一些CYVCV檢測為陽性的柑橘品種葉片上并未表現(xiàn)出柑橘黃化脈明病的典型癥狀,這表明CYVCV在不同柑橘品種上可能具有癥狀上的差異,可能還有潛隱危害的特點(diǎn)。本研究對廣西樣品進(jìn)行了針對柑橘上3種可能感染的病毒柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘碎葉病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)及蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)的檢測和分析,結(jié)果表明,CTV的檢出率最高,達(dá)到82.14%,而且50%以上樣品檢測出病毒復(fù)合侵染,表明廣西柑橘上的復(fù)合侵染嚴(yán)重。為了明確不同地區(qū)分離物的遺傳多樣性,本研究測定了受CYVCV感染的5個(gè)分離物全序列(YN-RL、SC-AY、HB-WH、GX-NNX及GX-NNZ),并對其進(jìn)行了基因組結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明,所獲得的所有分離物均具有與已知CYVCV相似的基因組結(jié)構(gòu),基因組長度在7529 bp~7531 bp之間。對采自世界不同地區(qū)的40個(gè)CYVCV分離物進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果顯示中國分離物具有一定的地理相關(guān)性,與寄主相關(guān)性不明顯。此外,群體中性檢測參數(shù)D值達(dá)到顯著負(fù)值,這表明CYVCV群體呈現(xiàn)正在擴(kuò)張的明顯趨勢。重組分析結(jié)果顯示,在40個(gè)分離物中存在1個(gè)重組事件和4個(gè)潛在的重組事件。遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn),CYVCV群體在各區(qū)段均呈現(xiàn)較低的核苷酸多樣性。CYVCV群體的單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)分別為1.000±0.006和0.01629±0.00192,表明CYVCV群體具有豐富的遺傳多樣性。TGBp3區(qū)變異最大,TGBp1、RdRp和TGBp2區(qū)的平均核苷酸變異位點(diǎn)較多,P23的平均核苷酸變異位點(diǎn)最少。IR2區(qū)的Hd值和Pi值分別為0.192±0.083、0.01190±0.00572,大于編碼區(qū)P23的Pi值,小于編碼區(qū)RdRp、TGBp1、TGBp2、TGBp3和CP區(qū)的Pi值,這表明CYVCV群體內(nèi)TGBp3區(qū)的遺傳變異最大,受到的選擇壓力較弱;編碼區(qū)P23較為保守,其受到的選擇壓力較強(qiáng)。本研究以四川檸檬、湖北檸檬、廣西顯癥香橙及廣西無癥香橙為材料,分別構(gòu)建了CYVCV TGB、CP和P23基因的15個(gè)自然種群SC-AY-TGB、YN-RL-TGB、HB-WH-TGB、GX-NNX-TGB、GX-NNZ-TGB、SC-AY-CP、YN-RL-CP、HB-WH-CP、GX-NNX-CP和GX-NNZ-CP,SC-AY-P23、YN-RL-P23、HB-WH-P23、GX-NNX-P23、GX-NNZ-P23,并對各個(gè)種群的遺傳結(jié)構(gòu)、變異特點(diǎn)及堿基突變類型進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,CYVCV具有 準(zhǔn)種‖結(jié)構(gòu),隨機(jī)兩個(gè)地區(qū)之間未發(fā)現(xiàn)完全相同的克隆。在15個(gè)種群中,各種群主序列均不占據(jù)絕對優(yōu)勢,變異序列占比很大,CYVCV突變克隆百分率超過70.00%和突變頻率在10~(-3)數(shù)量級。四個(gè)地區(qū)CYVCV TGB、CYVCV CP和CYVCV P23自然種群變異類型全部為突變,其突變頻率在同一數(shù)量級等級(10~(-3)),但不同地區(qū)自然種群間突變頻率有所差異。其中,突變頻率最高的是廣西無癥香橙種群(GX-NNZ-P23),為3.17×10~(-3)。突變頻率最低的是四川檸檬種群(SC-AY-TGB),為1.27×10~(-3)。本研究種群CYVCV TGB有明顯的T→C堿基突變傾向,種群CYVCV CP有明顯的A→G堿基突變傾向,種群CYVCV P23有明顯的T→C和A→G堿基突變傾向。CYVCV TGB種群堿基突變主要分布于TGBp1區(qū)和TGBp2區(qū)的5‘端,TGBp3區(qū)存在較少堿基的突變現(xiàn)象,這表明在CYVCV TGB種群內(nèi)TGBp1和TGBp2變異程度較高,TGBp3較為保守。;CYVCV CP種群堿基突變呈均勻分布;CYVCV P23種群堿基突變分布在3‘端和5‘端,中部分布較少。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S436.66
【部分圖文】：

測定 RNA 濃度，用分光光度儀測得 RNA 濃度為 396.44 ng/μL OD260/OD280 的比值為 1.87。說明提取總 RNA 的質(zhì)量比較好，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)（圖 2.1）。圖2.1 中國四個(gè)地區(qū)柑橘病葉總RNAFigure 2.1 Total RNA of Citrus samples from four regions in ChinaM：Marker2000+ 1:云南樣品, 2: 四川樣品, 3: 湖北樣品, 4: 廣西樣品M：Marker2000+ 1 sample from Yunnan provice, 2:sample from Sichuan provice, 3: sample from Hubei priovince,4: sample from Guangxi provice3.1.2 RT-PCR 檢測結(jié)果35 Cycles

提取所有病樣的總RNA，利用CYVCV的特異性引物進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明從86份樣品中有56份樣品能夠擴(kuò)增得到預(yù)期約614bp的條帶，與陽性對照擴(kuò)增條帶大小一致（圖2.2），我們對每個(gè)地區(qū)每個(gè)樣品的檢出情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表2-2）。圖2.2 部分樣品CYVCV RT-PCR檢測結(jié)果Figure 2.2 The detection of CYVCV by RT-PCR注：M1：Marker2000+, 1-19: 部分樣品, 20：陽性對照, 21：陰性對照Note：M: Marker5000, 1-19:particial samples, 20: Positive control, 21: Negative contro.表 2-2 柑橘樣品 CYVCV RT-PCR 檢測結(jié)果Table 2-2 Detection of CYVCV in citrus samples by RT-PCR樣品編號Sample No檢測結(jié)果Detection resultsYN-NM 1-11 - - + + + + - + + + +YN-YZ 1-12 - - - + - - - - - + - -HB-GJ 1-5 + + + + +SC-NM 1-15 + + + + - - + + + + + + + + +SC-NM 16-30 + + + + + + + + + - + + + - +GX-XC 1-15 + - + + - + - + - + - - + -GX-XC 16-30 - + - - - + - - + + + + + +注：“+”表示檢測呈陽性；“-”表示未檢出該病。YN-NM 1-11 表示云南檸檬樣品 1-11 號、YN-YZ 1-12 表示云南柚子樣品 1-12 號、HB-GJ 1-5 表示湖北檸檬樣品 1 號、湖北其他柑橘樣品 2-5 號、SC-NM 1-15 表示四川檸檬樣品 1-15 號、SC-NM 16-30 表示四川檸檬樣品 16-30 號、GX-XC1-17 表示廣西香橙樣品 1-15 號、GX-XC16-30 廣西香橙樣品 16-30 號，其中 GX-XC-7、GX-XC-9 表示健康香橙株。Note: “+” positive samples; “-” negative samples3.1.3 CYVCV 在各省不同寄主樣品中的檢出率進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在云南采集的12份柚子樣品中，有2個(gè)樣品檢測出CYVCV，檢出率為 16.67%；在云南采集的 11 份檸檬樣品中，有 8 個(gè)樣品檢測出 CYVCV

第二章 田間樣品中 CYVCV 的 RT-PCR 檢測區(qū)樣品中 4 種病毒的 RT-PCR 檢測YVCV、ASGV、CTV、CTLV 特異性檢測引物，CTL：F /R，ASGV-JC：F/R，CTV-JC：F/R。提取廣西樣品的NA，PCR 檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 28 份香橙樣品中，預(yù)期約 614bp 的條帶，與 CYVCV 陽性對照擴(kuò)增條帶大小有 7 份樣品能夠擴(kuò)增得到預(yù)期大小 889bp 的條帶，與 CT小一致，鑒定為 CTLV。有 7 樣品能夠擴(kuò)增得到預(yù)期大小 7性對照擴(kuò)增條帶大小一致，鑒定為 ASGV。有 23 份樣品能61bp 的條帶，與 CTV 陽性對照擴(kuò)增條帶大小一致，鑒定究對 28 份樣品中這 4 種病毒的檢測情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)（表

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本文編號：2819601