微孢子蟲(chóng)(Microsporidia)是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞真核生物,能夠感染從無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物在內(nèi)的幾乎所有動(dòng)物,包括重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)蜜蜂、家蠶甚至免疫缺陷的病人。微孢子蟲(chóng)的生活史與宿主緊密聯(lián)系,一般分為三個(gè)階段:感染期、裂殖增殖期和孢子形成期,其中裂殖增殖期既是細(xì)胞內(nèi)發(fā)育的起始時(shí)期,也是微孢子蟲(chóng)在宿主細(xì)胞中快速增殖、傳播的關(guān)鍵階段。因此截?cái)嗷蛳拗萍倚Q微粒子蟲(chóng)的裂殖增殖是微孢子蟲(chóng)防控的重要策略。Septin是一類高度保守的GTP結(jié)合蛋白,廣泛存在于酵母、線蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物等除植物以外的真核生物中。在其他真菌中的研究表明,Septin可以通過(guò)形成細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和招募蛋白等方式參與細(xì)胞分裂這一重要生物學(xué)過(guò)程。因此,我們以Septin的研究為切入點(diǎn)開(kāi)展微孢子蟲(chóng)裂殖增殖的相關(guān)研究,以期更加深入的了解微孢子蟲(chóng)裂殖增殖形式和周期。本研究以釀酒酵母的Septins序列為模板,篩選家蠶微粒子蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù),獲得家蠶微粒子蟲(chóng)的3個(gè)Septin基因,通過(guò)序列分析、保守性分析、轉(zhuǎn)錄特征分析、亞細(xì)胞定位特征分析和互作分析等對(duì)家蠶微粒子蟲(chóng)的Septins進(jìn)行鑒定,并分析其在裂殖增殖期的作用。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.家蠶微粒子蟲(chóng)Septins蛋白的鑒定及轉(zhuǎn)錄特征分析本研究利用生物信息學(xué)方法,基于家蠶微粒子蟲(chóng)CQI株基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組保守結(jié)構(gòu)域分析以及利用釀酒酵母的7個(gè)Septin序列為模板,在家蠶微粒子蟲(chóng)CQI株基因組中篩選到了三個(gè)septin基因,分別命名為NbSeptin1(GenBank NO:AGT97394.1,NbSPT1)、NbSeptin2(GenBank NO:EOB13962.1,NbSPT2)和NbSeptin3(GenBank NO:AHN50233.1,NbSPT3)。氨基酸序列分析顯示,NbSPT1預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為35.02 kDa,理論等電點(diǎn)pI 5.49。NbSPT2預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為37.28 kDa,理論等電點(diǎn)pI 7.98。NbSPT3預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為40.75 kDa,理論等電點(diǎn)pI 4.67。通過(guò)對(duì)三個(gè)NbSeptin的氨基酸序列進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其均存在Septin蛋白家族保守的GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域。多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)3個(gè)NbSeptin的氨基酸序列差異較大,說(shuō)明NbSPT1、NbSPT2和NbSPT3可能發(fā)揮著不一樣的功能。進(jìn)化分析結(jié)果顯示,多種微孢子蟲(chóng)中都存在NbSeptin的同源基因,表明在微孢子蟲(chóng)中Septin蛋白的分布較為保守,且3個(gè)septin的同源基因分別聚為一枝,說(shuō)明Septin在不同的微孢子蟲(chóng)中可能發(fā)揮著相似的作用。同時(shí)NbSPT1與S.cerevisiae CDC11、SHS1、SPR28、CDC12和SPR3聚為一枝,NbSPT2與S.cerevisiae CDC3聚為一枝,NbSPT3與S.cerevisiae CDC10聚為一枝,說(shuō)明NbSeptin的功能可能與其對(duì)應(yīng)的釀酒酵母Septin的功能具有相似性。為了了解家蠶微粒子蟲(chóng)增殖過(guò)程中NbSeptins的轉(zhuǎn)錄特征,以感染家蠶微粒子蟲(chóng)1~4 d的Sf9細(xì)胞為材料,通過(guò)RT-qPCR進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示三個(gè)NbSeptin在家蠶微粒子蟲(chóng)感染細(xì)胞的1~4d均能檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄,且均在第二天高量轉(zhuǎn)錄,推測(cè)NbSeptins可能在家蠶微粒子蟲(chóng)裂殖增殖期發(fā)揮重要作用。2.NbSeptins的抗體制備及亞細(xì)胞定位分析基于家蠶微粒子蟲(chóng)NbSPT1、NbSPT2和NbSPT3的基因序列設(shè)計(jì)特異引物,采用PCR擴(kuò)增的方法克隆三個(gè)基因并構(gòu)建pColdI-NbSPT1、pET30-NbSPT2和pColdI-NbSPT3表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化到E.coli Rosseta表達(dá)菌,經(jīng)0.2 mM IPTG誘導(dǎo)劑在16℃和180 rpm條件下誘導(dǎo)獲得NbSeptins的重組蛋白。目的蛋白經(jīng)親和層析純化后免疫小鼠和兔子,制備了多克隆抗體。免疫印跡分析顯示在家蠶微粒子蟲(chóng)成熟孢子和感染家蠶微粒子蟲(chóng)的Sf9細(xì)胞的總蛋白中,anti-NbSPT1、anti-NbSPT2和anti-NbSPT3分別能夠檢測(cè)到35 kDa、37 kDa和40 kDa左右的蛋白條帶,大小與預(yù)測(cè)的分子量一致。建立家蠶微粒子蟲(chóng)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞模型,采用間接免疫熒光技術(shù)(IFA)對(duì)NbSeptins在感染家蠶微粒子蟲(chóng)的Sf9細(xì)胞中的定位進(jìn)行分析顯示,NbSeptins主要定位于裂殖體膜,且NbSPT1與NbSPT3、NbSPT2與NbSPT3在裂殖體膜上存在共定位,而NbSPT2與NbSPT3在部分家蠶微粒子蟲(chóng)的一對(duì)耦核之間存在線狀共定位,表明NbSeptins在家蠶微粒子蟲(chóng)裂殖增殖期發(fā)揮功能,且NbSPT2和NbSPT3可能跟家蠶微粒子蟲(chóng)細(xì)胞核的分裂有關(guān)。3.家蠶微粒子蟲(chóng)NbSeptins的互作分析鑒于NbSeptins在裂殖體膜上具有共定位特征,且Septins蛋白常以聚合體形式行使功能,本部分采用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)分析NbSeptins的相互作用關(guān)系。構(gòu)建酵母雙雜交載體pGBKT7-NbSPT1、pGBKT7-NbSPT2、pGADT7-NbSPT1和pGADT7-NbSPT3載體轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞融合以檢測(cè)NbSeptins之間的相互作用,結(jié)果顯示融合后的Y187[pGADT7-NbSPT1]/AH109[pGBKT7-NbSPT2]、Y187[pGADT7-NbSPT3]/AH109[pGBKT7-NbSPT1]和Y187[pGADT7-NbSPT3]/AH109[pGBKT7-NbSPT2]能夠激活下游報(bào)告基因的表達(dá),證明NbSPT1、NbSPT2和NbSPT3之間存在相互作用。利用免疫共沉淀技術(shù),分別提取感染家蠶微粒子蟲(chóng)的Sf9細(xì)胞總蛋白和成熟家蠶微粒子蟲(chóng)蛋白,以NbSPT2和NbSPT3為誘餌蛋白沉淀互作蛋白,采用免疫印跡分析NbSPT1、NbSPT2和NbSPT3的互作關(guān)系。結(jié)果表明NbSPT1、NbSPT2和NbSPT3之間存在相互作用,說(shuō)明NbSeptins之間是可以通過(guò)形成異源聚合物在家蠶微粒子蟲(chóng)中發(fā)揮功能。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S884.21;Q933
【部分圖文】：

圖 1.1 微孢子蟲(chóng)超微結(jié)構(gòu)[74]Fig. 1.1 Ultrastructure of microsporidia spo壁；A：錨定盤(pán)；Lp：極膜層；Pt：極管；Pv：n: electron-lucent region, endospore; A: anchoring

iferative Phase）和孢子形成期（Sporognic Phase）（圖1.2）[15,74]。感染期：感染期也可以分為三個(gè)階段，成熟孢子從宿主細(xì)胞中釋放出來(lái)，孢子在環(huán)境中傳播，外界因素刺激孢子發(fā)芽[9,70]。研究證明，微孢子蟲(chóng)進(jìn)入細(xì)胞主要有兩種方式：一種是主動(dòng)入侵，在適當(dāng)條件下，通過(guò)彈射極管，刺穿宿主細(xì)胞膜，并將其孢原質(zhì)輸送到宿主細(xì)胞質(zhì)中，留下的空殼和極管被降解；另一種是通過(guò)吞噬作用，外界環(huán)境的微孢子蟲(chóng)被吞噬進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)釋放孢原質(zhì)[9,24]。這時(shí)候的孢原質(zhì)沒(méi)有固定的形態(tài)，內(nèi)部的胞質(zhì)成分等也是散亂的，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的細(xì)胞核與胞質(zhì)的重排，真正的細(xì)胞膜開(kāi)始形成，并合成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，最終發(fā)育成球形細(xì)胞，開(kāi)始進(jìn)入裂殖增殖期[69]。裂殖增殖期：也稱營(yíng)養(yǎng)生殖期（Vegetative stage），這一時(shí)期是微孢子蟲(chóng)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)育的起始階段，并與宿主細(xì)胞質(zhì)直接接觸。孢原質(zhì)在進(jìn)入宿主細(xì)胞后，

圖 1.3 出芽早期的截面圖[8]Fig. 1.3 Sections from a serial set through an early bud為從縱切面觀察到的組成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的絲；為從橫切面觀察到的內(nèi)側(cè)部分顯示的組成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的絲；標(biāo)尺為 0.1s form ring structure (arrows) in longitudinal view.

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號(hào)：2817705