胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacterium carotovorum)是引起植物軟腐病的重要病原物,寄主范圍十分廣泛,在世界各地均有發(fā)現(xiàn),由該致病菌引起的病害給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來嚴(yán)重的損失。隨著DNA測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和普及,加快了基因組學(xué)的發(fā)展,為探索病原微生物的遺傳規(guī)律和致病機(jī)理提供了豐富的數(shù)據(jù)和行之有效的方法。目前,對(duì)于胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliense)的基因組信息及致病性調(diào)控機(jī)理鮮有報(bào)道。本研究采用DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種BZA12菌株進(jìn)行了全基因組測(cè)序,并通過生物信息學(xué)的方法從基因組水平分析病原菌的致病相關(guān)基因特征,篩選出該病原菌與致病相關(guān)的候選效應(yīng)蛋白基因,并初步探索其功能。取得主要結(jié)果如下:1.本研究對(duì)采自遼寧省不同地區(qū)的黃瓜和茄子細(xì)菌性軟腐病樣進(jìn)行分離培養(yǎng),并進(jìn)行細(xì)菌生理生化和分子生物學(xué)鑒定及致病力測(cè)定。結(jié)果表明,在黃瓜病樣中分離出的病原菌鑒定為胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種,茄子病樣中分離出的病原菌鑒定為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種為遼寧省設(shè)施茄子生產(chǎn)上新發(fā)現(xiàn)病害。所有菌株在菌落形態(tài)上無明顯差異。生理生化分析表明,兩種病原物在α-甲基葡萄糖苷的利用,對(duì)麥芽糖產(chǎn)酸,蔗糖還原能力和D-山梨醇利用上存在差異。分子生物學(xué)分析表明,黃瓜上分離的菌株在Pcb特異性引物的擴(kuò)增下可以產(chǎn)生320bp的條帶,而茄子上分離的菌株不能,但在Pcc特異性引物的擴(kuò)增下可以產(chǎn)生550bp的條帶。ITS-RFLP引物擴(kuò)增及基于16Sr DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析均可將茄子和黃瓜上分離的菌株區(qū)分為兩種不同的病原菌。致病力測(cè)定結(jié)果顯示菌株編號(hào)為BZA的菌株致病力最強(qiáng)。2.本研究基于二代測(cè)序Hiseq 2500 Illumina和三代測(cè)序Pacbio RSII兩種DNA測(cè)序技術(shù)結(jié)合的方法對(duì)Pcb BZA12菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序,對(duì)該病原菌的基因組組分,基因功能注釋和比較基因組三個(gè)方面進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果表明,Pcb BZA12基因組大小為4924705 bp,GC含量51.97%,含有4508個(gè)編碼基因;共預(yù)測(cè)到串聯(lián)重復(fù)序列192個(gè),小衛(wèi)星序列139個(gè)和微衛(wèi)星序列10個(gè);預(yù)測(cè)出非編碼RNA tRNA 76個(gè),rRNA 22個(gè)和sRNA 26個(gè);功能注釋結(jié)果表明這些基因在細(xì)胞組分、膜組分、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)傳導(dǎo)等功能注釋的基因較多。致病相關(guān)基因分析結(jié)果顯示,該病原菌共預(yù)測(cè)出細(xì)胞壁降解酶類相關(guān)基因54個(gè),細(xì)菌Ⅰ~Ⅵ型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因215個(gè),毒素相關(guān)基因16個(gè)。比較基因組分析出胡蘿卜軟腐果膠桿菌三個(gè)亞種所共有的基因家族數(shù)量為3107個(gè),Pcb BZA12,Pco BC S7和Pcc PC1特有基因家族數(shù)量分別為36,22和11個(gè)。Pcb BZA12菌株的共有基因數(shù)量為3859個(gè),特有基因數(shù)量為649個(gè)。果膠桿菌系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,Pcb BZA12菌株與另外兩個(gè)Pcb菌株遺傳距離最近,與其他同屬不同種的菌株親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。3.本研究通過三種細(xì)菌Ⅲ型分泌效應(yīng)蛋白序列預(yù)測(cè)軟件來預(yù)測(cè)Pcb BZA12菌株的效應(yīng)蛋白,結(jié)合基因功能注釋信息,選取了五個(gè)注釋為假定蛋白的候選效應(yīng)蛋白,并在煙草上進(jìn)行基因的亞細(xì)胞定位和過敏性壞死分析,最后對(duì)產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明只有PCB_2483的候選效應(yīng)蛋白基因能引起煙草的過敏性壞死反應(yīng),亞細(xì)胞定位僅被定位在細(xì)胞核上。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,PCB_2483基因與已知的Pcb SX309和Pcc PCC21菌株的基因相似度在98%左右,由305個(gè)氨基酸組成,堿性氨基酸所占比例最大,發(fā)現(xiàn)1個(gè)可能與之存在互作關(guān)系的蛋白,二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)所占比例較大,是一種具有親水性,含脂類較高的蛋白。4.本研究利用T線性化自殺載體p LP12與目的基因的上下同源臂融合基因構(gòu)建了PCB_2483基因的缺失突變體菌株,同時(shí)構(gòu)建了該突變菌株的功能互補(bǔ)菌株,并連同野生菌株一起對(duì)三個(gè)菌株的致病性,過敏性和一些生物學(xué)特性進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示,突變菌株的致病性、生長(zhǎng)速率、游動(dòng)性、生物膜的形成,與野生型和互補(bǔ)菌株存在一些差異。對(duì)細(xì)菌的沉降性,胞外酶的水解能力,煙草的過敏性反應(yīng)方面未產(chǎn)生明顯差異。
【學(xué)位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S436.31
【部分圖文】：

圖 2-1 菌落形態(tài)特征Figure 2-1 The morphological characteristic of colony3 柯赫氏法則驗(yàn)證將分離得到的菌株分別重新接種到健康的黃瓜和茄子的果實(shí)、莖稈和葉片上，48后觀察接菌結(jié)果顯示，所有菌株均能引起寄主植物產(chǎn)生軟腐病，其病癥與田間癥狀一致（圖 2-2）。從接種的組織中再次分離的菌株與原始菌株的生物學(xué)，分子生物性一致，確認(rèn)分離的細(xì)菌菌株為致病菌。AB C

圖 2-1 菌落形態(tài)特征Figure 2-1 The morphological characteristic of colony赫氏法則驗(yàn)證離得到的菌株分別重新接種到健康的黃瓜和茄子的果實(shí)、莖稈和葉片察接菌結(jié)果顯示，所有菌株均能引起寄主植物產(chǎn)生軟腐病，其病癥與田（圖 2-2）。從接種的組織中再次分離的菌株與原始菌株的生物學(xué)，分致，確認(rèn)分離的細(xì)菌菌株為致病菌。EB CF

第二章 胡蘿卜軟腐果膠桿菌的分離與鑒定分子生物學(xué)鑒定carotovorum PEL 基因設(shè)計(jì)的特異性引物 Y1/Y2 對(duì)供試菌株進(jìn)示所有菌株均產(chǎn)生了一個(gè) 430 bp 左右的片段，可以認(rèn)為這些種。然后分別用 Pcb 菌株的特異性引物 BR1f / L1 和 Pcc 菌株P(guān)CCR 進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，在黃瓜上分離的病原菌均擴(kuò)增cb 菌株特異性引物擴(kuò)增出的預(yù)期條帶大小相符，而在茄子上 550 bp 大小的片段，與 Pcc 菌株的特異性引物預(yù)期片段相S rDNAITS 區(qū) PCR 擴(kuò)增出 550 和 580 兩條主要條帶，然后將黃瓜上分離的病原菌和茄子上分離的病原菌產(chǎn)生完全不同的M 1 2 3 4 5 6 7 8A1 2 3 4 M20B

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7 歐z延

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