胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacterium carotovorum)是引起植物軟腐病的重要病原物,寄主范圍十分廣泛,在世界各地均有發(fā)現(xiàn),由該致病菌引起的病害給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟帶來嚴重的損失。隨著DNA測序技術的進步和普及,加快了基因組學的發(fā)展,為探索病原微生物的遺傳規(guī)律和致病機理提供了豐富的數(shù)據(jù)和行之有效的方法。目前,對于胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliense)的基因組信息及致病性調(diào)控機理鮮有報道。本研究采用DNA測序技術對胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種BZA12菌株進行了全基因組測序,并通過生物信息學的方法從基因組水平分析病原菌的致病相關基因特征,篩選出該病原菌與致病相關的候選效應蛋白基因,并初步探索其功能。取得主要結果如下:1.本研究對采自遼寧省不同地區(qū)的黃瓜和茄子細菌性軟腐病樣進行分離培養(yǎng),并進行細菌生理生化和分子生物學鑒定及致病力測定。結果表明,在黃瓜病樣中分離出的病原菌鑒定為胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種,茄子病樣中分離出的病原菌鑒定為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種為遼寧省設施茄子生產(chǎn)上新發(fā)現(xiàn)病害。所有菌株在菌落形態(tài)上無明顯差異。生理生化分析表明,兩種病原物在α-甲基葡萄糖苷的利用,對麥芽糖產(chǎn)酸,蔗糖還原能力和D-山梨醇利用上存在差異。分子生物學分析表明,黃瓜上分離的菌株在Pcb特異性引物的擴增下可以產(chǎn)生320bp的條帶,而茄子上分離的菌株不能,但在Pcc特異性引物的擴增下可以產(chǎn)生550bp的條帶。ITS-RFLP引物擴增及基于16Sr DNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析均可將茄子和黃瓜上分離的菌株區(qū)分為兩種不同的病原菌。致病力測定結果顯示菌株編號為BZA的菌株致病力最強。2.本研究基于二代測序Hiseq 2500 Illumina和三代測序Pacbio RSII兩種DNA測序技術結合的方法對Pcb BZA12菌株進行全基因組測序,對該病原菌的基因組組分,基因功能注釋和比較基因組三個方面進行了系統(tǒng)分析。結果表明,Pcb BZA12基因組大小為4924705 bp,GC含量51.97%,含有4508個編碼基因;共預測到串聯(lián)重復序列192個,小衛(wèi)星序列139個和微衛(wèi)星序列10個;預測出非編碼RNA tRNA 76個,rRNA 22個和sRNA 26個;功能注釋結果表明這些基因在細胞組分、膜組分、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、膜轉(zhuǎn)運和信號傳導等功能注釋的基因較多。致病相關基因分析結果顯示,該病原菌共預測出細胞壁降解酶類相關基因54個,細菌Ⅰ~Ⅵ型分泌系統(tǒng)相關基因215個,毒素相關基因16個。比較基因組分析出胡蘿卜軟腐果膠桿菌三個亞種所共有的基因家族數(shù)量為3107個,Pcb BZA12,Pco BC S7和Pcc PC1特有基因家族數(shù)量分別為36,22和11個。Pcb BZA12菌株的共有基因數(shù)量為3859個,特有基因數(shù)量為649個。果膠桿菌系統(tǒng)進化樹分析表明,Pcb BZA12菌株與另外兩個Pcb菌株遺傳距離最近,與其他同屬不同種的菌株親緣關系相對較遠。3.本研究通過三種細菌Ⅲ型分泌效應蛋白序列預測軟件來預測Pcb BZA12菌株的效應蛋白,結合基因功能注釋信息,選取了五個注釋為假定蛋白的候選效應蛋白,并在煙草上進行基因的亞細胞定位和過敏性壞死分析,最后對產(chǎn)生過敏性壞死反應的基因進行生物信息學分析。結果表明只有PCB_2483的候選效應蛋白基因能引起煙草的過敏性壞死反應,亞細胞定位僅被定位在細胞核上。生物信息學分析結果顯示,PCB_2483基因與已知的Pcb SX309和Pcc PCC21菌株的基因相似度在98%左右,由305個氨基酸組成,堿性氨基酸所占比例最大,發(fā)現(xiàn)1個可能與之存在互作關系的蛋白,二級結構中α螺旋和無規(guī)則卷曲結構所占比例較大,是一種具有親水性,含脂類較高的蛋白。4.本研究利用T線性化自殺載體p LP12與目的基因的上下同源臂融合基因構建了PCB_2483基因的缺失突變體菌株,同時構建了該突變菌株的功能互補菌株,并連同野生菌株一起對三個菌株的致病性,過敏性和一些生物學特性進行比較分析。結果顯示,突變菌株的致病性、生長速率、游動性、生物膜的形成,與野生型和互補菌株存在一些差異。對細菌的沉降性,胞外酶的水解能力,煙草的過敏性反應方面未產(chǎn)生明顯差異。
【學位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S436.31
【部分圖文】：

圖 2-1 菌落形態(tài)特征Figure 2-1 The morphological characteristic of colony3 柯赫氏法則驗證將分離得到的菌株分別重新接種到健康的黃瓜和茄子的果實、莖稈和葉片上，48后觀察接菌結果顯示，所有菌株均能引起寄主植物產(chǎn)生軟腐病，其病癥與田間癥狀一致（圖 2-2）。從接種的組織中再次分離的菌株與原始菌株的生物學，分子生物性一致，確認分離的細菌菌株為致病菌。AB C

圖 2-1 菌落形態(tài)特征Figure 2-1 The morphological characteristic of colony赫氏法則驗證離得到的菌株分別重新接種到健康的黃瓜和茄子的果實、莖稈和葉片察接菌結果顯示，所有菌株均能引起寄主植物產(chǎn)生軟腐病，其病癥與田（圖 2-2）。從接種的組織中再次分離的菌株與原始菌株的生物學，分致，確認分離的細菌菌株為致病菌。EB CF

第二章 胡蘿卜軟腐果膠桿菌的分離與鑒定分子生物學鑒定carotovorum PEL 基因設計的特異性引物 Y1/Y2 對供試菌株進示所有菌株均產(chǎn)生了一個 430 bp 左右的片段，可以認為這些種。然后分別用 Pcb 菌株的特異性引物 BR1f / L1 和 Pcc 菌株PCCR 進行擴增，結果顯示，在黃瓜上分離的病原菌均擴增cb 菌株特異性引物擴增出的預期條帶大小相符，而在茄子上 550 bp 大小的片段，與 Pcc 菌株的特異性引物預期片段相S rDNAITS 區(qū) PCR 擴增出 550 和 580 兩條主要條帶，然后將黃瓜上分離的病原菌和茄子上分離的病原菌產(chǎn)生完全不同的M 1 2 3 4 5 6 7 8A1 2 3 4 M20B

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7 歐z延

本文編號：2817391