水稻黃單胞菌棲稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc),俗稱(chēng)水稻條斑病菌是水稻重要的細(xì)菌性病原物之一,能侵染水稻產(chǎn)生細(xì)菌性條斑病(bacterial leaf streak,BLS),造成水稻嚴(yán)重減產(chǎn)。Xoc主要通過(guò)葉片的氣孔和傷口侵染水稻,并定殖在葉肉組織的質(zhì)外體,導(dǎo)致脈間失綠,形成失綠條斑。至今尚未在水稻中發(fā)現(xiàn)抗BLS的主效抗病基因,亟待發(fā)展有效的防治BLS方法。已有研究表明趨化性在細(xì)菌的侵染前期起到關(guān)鍵作用,然而,目前我們對(duì)Xoc的趨化受體的功能及作用機(jī)理尚未了解清楚。趨化受體,也稱(chēng)甲基化受體蛋白(methyl-accepting chemotaxis protein,MCP),在細(xì)菌趨化中接受化學(xué)信號(hào)并將信號(hào)傳遞到下游,從而引發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生趨利避害的一種行為,為了弄清X(qián)oc中的甲基化受體蛋白MCP的功能,對(duì)Xoc GX01菌株中注釋的甲基趨化受體基因mcp和一個(gè)鞭毛合成相關(guān)基因進(jìn)行突變研究,主要結(jié)果如下:1.Xoc GX01基因組中mcp基因注釋及編碼產(chǎn)物分析。通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)Xoc GXO1菌株的基因組進(jìn)行分析,確定該菌株具有19個(gè)mcp基因。通過(guò)KEGG的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)Xoc BLS256的部分mcp基因在注釋中不完整,在Xoc GXO1的注釋中,XOC2399和XOC1592的編碼產(chǎn)物都具有雙重跨膜結(jié)構(gòu)域,形成完整的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ligand binding domain,LBD)。2.基于同源雙交換方法構(gòu)建mcp基因突變體。通過(guò)PCR的方法獲取mcp基因的上下游片段,與自殺質(zhì)粒pK18mobsacB載體進(jìn)行連接成重組質(zhì)粒,通過(guò)三親本接合的方法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到Xoc GX01菌株中,經(jīng)過(guò)兩次重組交換的篩選和驗(yàn)證,構(gòu)建了11個(gè)mcp基因的突變體和一個(gè)鞭毛合成相關(guān)基因的突變體。3.采用毛細(xì)管法對(duì)Xoc GX01野生型菌株和突變體菌株進(jìn)行趨化鑒定。在趨化鑒定中,Xoc GX01菌株對(duì)供試葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、葉子提取物、水稻研磨物、琥珀酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、丙氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、色氨酸、天冬酰胺、纈氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸具有明顯的趨化性。結(jié)果表明,Xoc GXO1野生型菌株和突變體菌株對(duì)部分化合物的趨化性保持不變,而對(duì)部分化合物的趨化性具有顯著差異,提示相應(yīng)的mcp基因與對(duì)應(yīng)的趨化物相關(guān)。4.Xoc GX01突變體表型檢測(cè)和致病力分析。對(duì)11個(gè)mcp突變體和一個(gè)鞭毛基因突變體進(jìn)行表型檢測(cè)和致病力檢測(cè),并對(duì)其中表型變化和致病力變化明顯的突變體進(jìn)行互補(bǔ)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),多數(shù)mcp基因突變后,不影響突變體的表型和致病力。而XOC2399基因的缺失導(dǎo)致細(xì)菌游動(dòng)性顯著下降、涌動(dòng)性顯著上升、胞外多糖上升、胞外蛋白酶輕微下降抗氧化能力上升、抗鹽能力降低、致病力顯著下降。△XOC2350游動(dòng)性顯著下降;△XOC1592、△XOC2048、△XOC2854生物膜形成能力降低;在壓滲致病實(shí)驗(yàn)中,△XOC2399、△XOC2048、△XOC2854的致病力下降;在壓滲和噴霧實(shí)驗(yàn)中,△XOC2350致病力上升。通過(guò)過(guò)敏反應(yīng)檢測(cè),證明mcp基因與三型系統(tǒng)沒(méi)有關(guān)系。5.XOC2399在趨化和致病中作用的鑒定。將帶有XOC2399基因的質(zhì)粒導(dǎo)入△XOC2399中,成功地恢復(fù)了多種表型,例如致病力、趨化性、運(yùn)動(dòng)能力和基本表型等,表明XOC2399在條斑病菌的趨化和致病中其重要作用。綜上所述,本研究系統(tǒng)地對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病Xoc GX01中的趨化受體相關(guān)基因進(jìn)行了部分突變,完成了對(duì)Xoc GX01菌株部分mcp基因功能的初步探索,鑒定了一個(gè)重要的mcp基因XOC2399,為后續(xù)深入研究mcp功能提供線索,以及對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病病害防治提供了參考。
【學(xué)位單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：S435.111.4
【部分圖文】：

等在不同的細(xì)菌中不僅序列保守，而且功能也相當(dāng)保守。而趨化受體基因和編碼鞭毛胞逡逑外結(jié)構(gòu)的基因則存在顯著差異和多樣性。逡逑典型的結(jié)構(gòu)如圖１－１所示Ｗ，由位于周質(zhì)空間的，感受外界信號(hào)并與外界信號(hào)結(jié)合逡逑的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域ＬＢＤ結(jié)構(gòu)域、位于膜上跨膜螺旋區(qū)ＴＭ區(qū)域，連接跨膜結(jié)構(gòu)域和胞逡逑質(zhì)信號(hào)區(qū)的ＨＡＭＰ區(qū)域，連接ＨＡＭＰ區(qū)域并與與下游多種調(diào)控蛋白進(jìn)行互作的胞質(zhì)信逡逑號(hào)區(qū)ＳＤ組成［１Ｑ】。逡逑如圖１－２所示，位于周質(zhì)空間中ＬＢＤ結(jié)構(gòu)域和跨膜螺旋ＴＭ結(jié)構(gòu)域可以分為以逡逑下幾類(lèi)：（圖１－１邋），根據(jù)ＴＭ結(jié)構(gòu)域數(shù)量，可以分為ｌａ型和ｌｂ型，而ｌａ型根據(jù)逡逑ＬＢＤ結(jié)構(gòu)域的大小可以分為ｄｕｓｔｅｒ邋Ｉ型和ｃｌｕｓｔｅｒ邋ＩＩ型［１１】，根據(jù)ＬＢＤ結(jié)構(gòu)域的有無(wú)逡逑劃分為Ｈｉｍ型和ｍｅ型［１２］，ＩＶａ型和ＩＶｂ型。逡逑Ｓ｜邋Ｔｏｐｏｌｃｇｙ邋ｔｙｐａ邋｜邐｜邋ｔａ邋）邐ｌｂ邐｜邋ＩＩ邋１邋［［邋｜邋１邐［物邐｜邋ＩＶｂ邋｜｜逡逑｜邋Ｏｕｓｔｅｒ邋Ｉ邋｜［邋Ｃｌｕｓｔｅｒ邋ＩＩ邋］逡逑ＴＭ２邐＾逡逑－邐�！笱健梗�！沿，！丨X襄義希椋觶椋駑義稀鰣危蹋簦紓幔睿溴澹猓椋睿洌椋睿玨澹洌錚恚幔椋鑠遑

本文編號(hào)：2814490