小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)屬于馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus),是侵染葫蘆科作物的主要病毒之一,可引起嚴(yán)重花葉、皺縮、果實(shí)畸形等癥狀,給葫蘆科作物的生產(chǎn)造成極為嚴(yán)重的損失。建立準(zhǔn)確的ZYMV檢測體系和種植抗病品種是目前最為有效的防治措施。本研究制備了ZYMV外殼蛋白特異性抗血清,分析了危害山東葫蘆科作物的ZYMV分離物的分類地位,構(gòu)建了ZYMV侵染性克隆并研究了HCpro WxxxG基序在ZYMV致病過程中的作用,篩選了抗ZYMV的葫蘆科作物品種,為有效防治ZYMV提供了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:(1)ZYMV CP特異性多克隆抗體的制備及應(yīng)用。利用ZYMV特異性引物擴(kuò)增CP基因編碼序列,并克隆到原核表達(dá)載體pEHISTEV上。通過對宿主菌種類、IPTG誘導(dǎo)時間及濃度等因素進(jìn)行篩選,獲得最佳表達(dá)條件:Rosetta菌株,利用0.2 mmol·L~(-1) IPTG誘導(dǎo)4 h。通過原核表達(dá)方法成功誘導(dǎo)表達(dá)出37 kDa左右的融合蛋白,將融合蛋白免疫健康新西蘭長耳兔獲得效價為1:32768的ZYMV CP特異性抗血清。與RT-PCR對比發(fā)現(xiàn),制備的抗血清具有高度的準(zhǔn)確性。利用該抗血清對西葫蘆(綠源冬寶)和甜瓜(火銀瓜)種子檢測發(fā)現(xiàn),種子帶毒率分別為39.8%、15.1%,幼苗帶毒率為2.56%和5.13%,對種子進(jìn)行熱處理可有效降低幼苗帶毒率。(2)ZYMV兩個山東分離物(CN:Cm:17、CN:Lc:17)全基因組序列的克隆及分析。在山東泰安采集到的有明顯黃花葉癥狀的絲瓜和南瓜樣品中檢測到ZYMV,利用RT-PCR和5′末端序列擴(kuò)增技術(shù)(RACE)獲得了兩個分離物的全基因組序列,分別命名為CN:Cm:17(南瓜分離物)和CN:Lc:17(絲瓜分離物)。序列分析結(jié)果表明,CN:Cm:17和CN:Lc:17基因組除Poly(A)尾巴外分別含有9,593和9,591個核苷酸(Nucleotides,nt),編碼一個含3 080氨基酸的多聚蛋白。在多聚蛋白氨基酸水平上,CN:Cm:17與CN:Lc:17一致率為96.7%,與NCBI數(shù)據(jù)庫中48個ZYMV分離物一致率分別為90.3%~97.8%、90.5%~98.4%。重組分析發(fā)現(xiàn),CN:Lc:17分離物內(nèi)具有顯著重組事件,為KR:KR-PA:05和CN:Cm:17兩個分離物的重組體�；诙嗑鄣鞍拙幋a序列的系統(tǒng)進(jìn)化聚類結(jié)果顯示分組與分離物的地理起源存在密切相關(guān)性,中國分離物分別聚集在A-V和A-VI亞組。(3)ZYMV CN:Cm:17分離物全長侵染性cDNA克隆的構(gòu)建。利用同源重組的方法將CN:Cm:17全基因組克隆到含35S啟動子的農(nóng)桿菌雙元載體pCam35S上,命名為pCamZYMV。將含有pCamZYMV的利用農(nóng)桿菌浸潤接種到西葫蘆(Cucurbita pepo)、南瓜(Cucurbita moschata)等寄主上,接種14天后表現(xiàn)與野生型ZYMV類似癥狀,侵染效率為100%,表明構(gòu)建的pCamZYMV具有較好的侵染性。將帶綠色熒光蛋白gfp基因序列插入到pCamZYMV侵染性克隆NIb和CP之間,獲得pCamZYMV-GFP。將其通過農(nóng)桿菌浸潤方法接種西葫蘆、南瓜,5天后接種葉上可觀察到綠色熒光,14天后系統(tǒng)葉片表現(xiàn)花葉癥狀,并在發(fā)病部位觀察到明顯綠色熒光。(4)WxxxG保守基序影響ZYMV致病力并參與HCpro抑制RNA沉默功能。在pCamZYMV-GFP侵染性克隆的HCpro編碼區(qū)域WxxxG基序保守位點(diǎn)引入突變,獲得單突變體W207A、G211A及雙突變體WG。將突變體接種至西葫蘆品種綠源冬寶發(fā)現(xiàn),突變W_(207)位點(diǎn)或WG位點(diǎn)均減輕癥狀,顯著降低病毒積累水平;突變G_(211)位點(diǎn)對病毒癥狀和積累水平無明顯影響。RNA沉默試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn),突變W_(207)位點(diǎn)對HCpro抑制RNA沉默能力無明顯影響,但突變G_(211)位點(diǎn)能夠顯著降低ZYMV HCpro抑制RNA沉默能力。(5)40個葫蘆科品種對ZYMV的抗性鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),精選唐山秋瓜和青豐長瓠子瓜為高抗品種;雪峰小玉五號和金福為抗病品種;津研四號、中農(nóng)28號、耐熱王中王、泰國中綠絲瓜、蟋蟀牌肉多多、高抗巨龍、盈克二號、浙蒲6號和佳麗蒲瓜9個為中抗品種。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S432.41
【部分圖文】：

目前已報(bào)道至少能夠侵染葫蘆科（Cuc（Asteraceae）等 11 個科的植物(唐超 等，201科作物后可產(chǎn)生嚴(yán)重的病毒病癥狀，致使果實(shí)顏至不結(jié)果，給農(nóng)戶造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。不同敏嚴(yán)重程度有差別，并且同一作物在不同生長條件葉片表現(xiàn)為脈明，后期老葉出現(xiàn)褪綠黃化、花葉等癥狀，果實(shí)局部膨大或顏色分布不均(彭斌 等、花葉，后期表現(xiàn)為明顯泡狀斑紋(陳遠(yuǎn)超 2014西瓜果實(shí)上呈現(xiàn)顏色不均勻的癥狀以及不同程度縮、畸形癥狀，特別的是葉緣呈鋸齒狀，果實(shí)裂芽率低(Leoq and Pitrat 1984; 朱英芝 2012)。

譯成一個多聚蛋白，被自身編碼的三個蛋白酶 P1、HCpro 和 NIa 切割成一和第二蛋白酶（P1 和 HCpro）分別在 EVDHS/S 和 YRVG/G 位點(diǎn)之間割（圖 1-2）。NIa 以反式切割的方式切割 P3、CI、VPg、CP 四個蛋白（兩端進(jìn)行自身催化裂解。另外，在 P3 編碼區(qū)域病毒通過 RNA 轉(zhuǎn)錄滑動或碼一個新蛋白 P3N-PIPO(Chungetal.,2008)。ZYMV 兩端的非編碼區(qū)域?qū)Ρ匦璧�，不�?ZYMV 分離物之間的非編碼區(qū)域序列存在較大差異。非編含 A、U 堿基（69％），與病毒基因組連接蛋白（VPg）共價連接，3′為 polOn2007)。RNA 病毒基因組較小，為了應(yīng)對其結(jié)構(gòu)限制同時盡量減少病毒的影響以及抵抗宿主的防御機(jī)制等，它們會利用各種策略來編碼或招募所以保證其侵染性。其中一種策略是依賴具有多功能的病毒蛋白的表達(dá)(VWeber and Bujarski 2015)。ZYMV 基因組編碼的蛋白大多具有多種功能，集中在 CP 和 HCpro 上，以下將針對這兩個蛋白進(jìn)行介紹。

小西葫蘆黃花葉病毒遺傳多樣性及致病力分析DN 中“D”對導(dǎo)致癥狀表達(dá)起到關(guān)鍵性作用，突變基序中的 D 為 G 喪壞死能力(Huetal.,2009)。ZYMVHCpro 中 CDN 突變?yōu)?CYN 后減輕但對于 HCpro 自身 RNA 沉默抑制活性無影響，但其參與 ZYMV 癥尚不清楚(Desbiez et al., 2010)。 C 端是最保守區(qū)域（氨基酸 301-456），具有半胱氨酸型蛋白酶活性 C 末端進(jìn)行自切割。C 端的 PTK 基序 N 端的 KLSC 基序共同參與人提出 ZYMV HCpro 參與蚜蟲傳播的分子機(jī)制可分為兩種不同的相梁假說”：一種是通過 PTK 基序與 CP N 末端的 DAG 基序直接相互的結(jié)合(Peng et al., 1998)，另一種是 KLSC 基序與蚜蟲口針之間的相, 1998)，Dombrovsky 等（2005）利用 TuMV CP 的 N 端替換 ZYMV 重組嵌合體證實(shí)了這一說法(Dombrovsky et al., 2005)。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2813882