蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuirigienss,Bt)為革蘭氏陽性細(xì)菌,其在芽胞形成的同時能夠產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs),對多種鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等害蟲具有特異性殺蟲活性。Bt因其廣泛的殺蟲譜和對環(huán)境友好等特點(diǎn),成為目前農(nóng)業(yè)上應(yīng)用最廣、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑。但在田間實(shí)際應(yīng)用過程中,Bt制劑面臨持效期短的問題,主要原因為殺蟲晶體蛋白在紫外線的照射下容易失活。已有研究表明細(xì)胞壁包裹晶體能夠有效地延長晶體蛋白對害蟲防治的持效期。前期研究發(fā)現(xiàn)了一個調(diào)控Bt母細(xì)胞裂解的關(guān)鍵性肽聚糖水解酶CwlC,其缺失后完全阻斷了母細(xì)胞的裂解,且不影響芽胞形成、晶體蛋白產(chǎn)生及生物殺蟲活性。本研究旨在明確CwlC分泌到胞外作用于細(xì)胞壁的降解機(jī)制以及cwlC基因的上游調(diào)控機(jī)制。主要的研究結(jié)果如下:利用“垂釣(pull-down)”方法和質(zhì)譜分析,初步篩選到20個功能基因,其編碼的蛋白可能與CwlC水解酶存在相互作用。通過生物信息學(xué)分析,選定pbp(基因編號為HD73_2479)和groEL(基因編號為HD73_0246)作為候選基因進(jìn)行下一步研究。pbp編碼青霉素結(jié)合蛋白PBP,groEL編碼分子伴侶GroEL蛋白。優(yōu)化大腸桿菌異源表達(dá)系統(tǒng),分別純化出PBP與GroEL蛋白。借助pull-down手段,進(jìn)一步驗證了 CwlC水解酶與PBP蛋白的體外互作關(guān)系;同時發(fā)現(xiàn)CwlC蛋白與GroEL蛋白并無互作關(guān)系。該研究結(jié)果為深入研究CwlC蛋白的分泌途徑和進(jìn)一步揭示Bt母細(xì)胞裂解機(jī)制奠定了基礎(chǔ);而且為有效解決Bt生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用問題提供科學(xué)依據(jù),為新一代Bt制劑的分子設(shè)計開辟遺傳改良的新途徑。通過DBTBS(http://dbtbs.hgc.jp/)在線初步預(yù)測調(diào)控cwlC基因的轉(zhuǎn)錄因子,并結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)分析其表達(dá)水平,選定在Bt生長晚期表達(dá)的編號為HD73 5824基因進(jìn)行功能分析。利用生物信息學(xué),明確了HD73_5824基因為yhcZ基因,HD73_5825基因為yhcY基因,推測兩者共同組成雙組份系統(tǒng)。借助同源重組手段,構(gòu)建了yhcZ基因的缺失突變體HD(△yhcZ),β-半乳糖苷酶活性檢測發(fā)現(xiàn),yhcZ基因不調(diào)控cwlC基因;通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),yhcZ基因缺失不影響母細(xì)胞的裂解;通過生長曲線測定發(fā)現(xiàn),yhcZ基因缺失顯著影響B(tài)t菌株的生長;碳源利用實(shí)驗表明,yhcZ負(fù)調(diào)控Bt對葡萄糖的利用;Biolog分析明確了yhcZ基因缺失影響B(tài)t對其他碳源的利用。該發(fā)現(xiàn)明確了yhcZ基因在Bt菌株生長過程中對葡萄糖及其他碳源的利用具有重要的促進(jìn)作用。本研究結(jié)果為解析YhcZ調(diào)控葡萄糖及碳源利用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),且為進(jìn)一步研究細(xì)菌生長及發(fā)酵提供參考。
【學(xué)位單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S476
【部分圖文】：

圖１．１邋Ｂｔ中的晶體和芽胞（楊靜妮，２０１３）逡逑邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｃｒｙｓｔａｌ邋ａｎｄ邋ｓｐｏｒｅ邋ｉｎ邋Ｂｔ邋（Ｙａｎｇ邋Ｊｉｎｇｎｉ，邋２０１３的防治逡逑治森林害蟲的非化學(xué)防治手段。ｖａｎ邋Ｆｒａｎｋｅ

ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ逡逑圖１－２細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組裝（Ｐａｒａｄｉｓ－Ｂｌｅａｕｅｒａ／．邋２０１０）逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｃｅｌｌ邋ｗａｌｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ａｎｄ邋ａｓｓｅｍｂｌｙ邋（Ｐａｒａｄｉｓ－Ｂｌｅａｕ邋ｅｌ邋ａｌ．邋２０１０）逡逑注：Ａ：細(xì)菌細(xì)胞外圍細(xì)胞壁示意圖邋Ｍ：邋ＴＶ－乙酰胞壁酸邋Ｇ：邋；Ｖ－乙酰葡萄糖胺逡逑Ｂ：邋ＰＧ組裝概述圖邋ＰＧＴ：肽聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域邋ＴＰ：轉(zhuǎn)肽酶結(jié)構(gòu)域逡逑圓點(diǎn)：吸附的肽邋綠色：ＰＧ層邋灰色：多蛋白復(fù)合物紫色Ａ類ＰＢＰ逡逑

Ｆｉｇ邋１－３邋Ｄｅｌｅｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｗｌＣ邋ｇｅｎｅ邋ａｆｆｅｃｔｓ邋ｍｏｔｈｅｒ邋ｃｅｌｌ邋ｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｂｔ邋ｓｔｒａｉｎ邋（Ｃｈｅｎ邋Ｘｉａｏｍｉｎ，邋２０１７）逡逑注：ＴＶ細(xì)菌對數(shù)生長期結(jié)束，進(jìn)入穩(wěn)定期邋Ｔ１６：細(xì)菌生長到％后再培養(yǎng)１６ｈ逡逑Ｔ２４：細(xì)菌生長到Ｔ0后再培養(yǎng)２４ｈ逡逑１．４青霉素結(jié)合蛋白的分類及功能逡逑１９７２年Ｓｕｇｉｎａｋａ等用放射性同位素對青霉素進(jìn)行標(biāo)記，觀察其在細(xì)菌表面的位，由此發(fā)現(xiàn)了可以與青霉素結(jié)合的蛋白，并將其命名為青霉素結(jié)合蛋白。ＰＢＰｓ能逡逑夠催化糖鏈的聚合（轉(zhuǎn)糖）和糖鏈間交聯(lián)（轉(zhuǎn)肽），在細(xì)菌肽聚糖的合成過程中起重逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2813654