亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)是我國玉米最重要的害蟲,了解亞洲玉米螟表皮形成的機制將有助于對其開展生物防治。表皮蛋白和幾丁質(zhì)是構成昆蟲表皮的兩種主要成分,因此研究兩者的相互作用對于闡明昆蟲表皮形成機制具有關鍵意義。CP26703、CP27370分別是亞洲玉米螟體壁、頭殼表皮轉(zhuǎn)錄組中相對豐度最高的表皮蛋白基因。序列分析發(fā)現(xiàn)CP26703、CP27370分別屬于CPR家族中RR-1、RR-2亞家族的表皮蛋白,含有RR結構域,推測可能是通過結合幾丁質(zhì)來發(fā)揮功能。為了研究這2種表皮蛋白CP26703、CP27370與幾丁質(zhì)的相互作用,本研究進行了以下工作:(1)通過對亞洲玉米螟頭殼和體壁表皮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析,以及與NCBI數(shù)據(jù)庫的對比,得到了表皮蛋白基因CP26703、CP27370的cDNA序列。對2種表皮蛋白的氨基酸序列分析可知,CP26703、CP27370的N端均存在信號肽序列,是分泌性的表皮蛋白;CP26703屬于親水性蛋白,但CP27370中存在一段強疏水性序列;2種蛋白均由β折疊和無規(guī)卷曲二級結構交替構成。多重序列比對結果表明,CPR家族表皮蛋白都存在高度保守的RR基序。(2)利用pET-SUMO載體實現(xiàn)了融合蛋白SUMO-CP26703和SUMO-CP27370的可溶表達,并通過SUMO蛋白酶處理及兩次金屬螯合親和層析純化得到了目的蛋白CP26703、CP27370,平均收率分別為5 mg/L、6 mg/L。(3)幾丁質(zhì)結合實驗發(fā)現(xiàn),2種表皮蛋白對不同類型幾丁質(zhì)的結合具有選擇性。CP26703對α-幾丁質(zhì)和脫乙酰幾丁質(zhì)結合能力很強,對膠體幾丁質(zhì)結合能力較強,但不與β-幾丁質(zhì)結合;CP27370對這4種幾丁質(zhì)結合能力普遍較弱,但與β-幾丁質(zhì)、脫乙酰幾丁質(zhì)的結合能力稍強。(4)脫乙酰幾丁質(zhì)(殼聚糖)結合實驗發(fā)現(xiàn),CP26703能與脫乙酰幾丁質(zhì)結合并使其發(fā)生團聚,但CP27370不能。圓二色光譜分析表明,CP26703在結合脫乙酰幾丁質(zhì)后,其二級結構中平行β折疊和β轉(zhuǎn)角比例分別上升了18.4%和11.7%,而反平行β折疊及無規(guī)卷曲的比例則分別下降了20.4%和11.4%;CP27370中反平行β折疊和β轉(zhuǎn)角的比例分別降低了10.0%和6.3%,而平行β折疊及無規(guī)卷曲的比例則分別提高了3.9%和10.5%。表明這2種表皮蛋白可以改變自身構象,從而實現(xiàn)與幾丁質(zhì)更好的結合。同時,蛋白CP26703的加入引起脫乙酰幾丁質(zhì)混合溶液的儲存模量(G’)變?yōu)樵瓉淼?.4倍,且復合黏度增大了87.0%。本研究發(fā)現(xiàn)了CPR家族的2種亞家族表皮蛋白RR-1、RR-2與不同類型幾丁質(zhì)的結合存在特異性,而且在結合過程中蛋白的二級結構會發(fā)生變化,這加深了對于CPR家族表皮蛋白與幾丁質(zhì)相互作用的認識,有助于進一步了解昆蟲表皮的形成機制。
【學位單位】：大連理工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S435.132

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本文編號：2811101