絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,能夠被細(xì)胞因子、激素和各種細(xì)胞應(yīng)激源等刺激物激活,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞對外界刺激的響應(yīng)。MAPK信號通路在生長發(fā)育、氧化應(yīng)激和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。中華蜜蜂(Apis cerana cerana)是中國主要的蜜蜂品種,對維持生態(tài)和農(nóng)業(yè)發(fā)展的平衡具有重大貢獻(xiàn)。然而自然生態(tài)環(huán)境的惡化使中華蜜蜂的生存與繁殖受到了威脅,因此了解中華蜜蜂在氧化應(yīng)激中的防御機(jī)制對其種群的發(fā)展具有重要意義。本研究以中華蜜蜂為實(shí)驗(yàn)材料,開展了MKK6基因的功能研究,從分子水平上探討了AccMKK6介導(dǎo)的MAPK級聯(lián)途徑在抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中的功能。具體研究結(jié)果如下:通過PCR的方法從中華蜜蜂中分離獲得AccMKK6的開放閱讀框,長度為1002bp,編碼一個333個氨基酸殘基的多肽,預(yù)測蛋白分子量約為37.63kDa,理論等電點(diǎn)為7.15。通過氨基酸序列比對以及進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),中華蜜蜂AccMKK6的氨基酸序列與其他物種有較高的同源性,且具有高度保守的磷酸化位點(diǎn)和催化結(jié)構(gòu)域。通過qRT-PCR方法對AccMKK6基因在中華蜜蜂不同組織部位和發(fā)育時期的表達(dá)特性進(jìn)行了研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),AccMKK6基因在胸部的表達(dá)量最高,其次是表皮和頭部;AccMKK6在中華蜜蜂各個發(fā)育階段中均有表達(dá),蛹期表達(dá)量較高。中華蜜蜂AccMKK6基因響應(yīng)非生物脅迫引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。通過qRT-PCR方法探究了AccMKK6在非生物脅迫中的表達(dá)特性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),AccMKK6基因的轉(zhuǎn)錄水平受過氧化氫、重金屬和農(nóng)藥等非生物脅迫誘導(dǎo)提高。Western blot結(jié)果在蛋白水平上進(jìn)一步證明AccMKK6受非生物脅迫的調(diào)控。過表達(dá)AccMKK6蛋白的大腸桿菌對非生物脅迫的抗性增強(qiáng)。通過抑菌實(shí)驗(yàn)分析重組AccMKK6蛋白的功能,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在H_2O_2和HgCl_2處理后過表達(dá)AccMKK6的大腸桿菌的抑菌圈小于對照組。中華蜜蜂AccMKK6基因沉默后抗氧化基因表達(dá)量和抗氧化酶活性降低。將dsAccMKK6注射入成年蜜蜂體內(nèi),qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,蜜蜂體內(nèi)AccMKK6的表達(dá)量顯著下降。通過檢測AccSOD1,AccSOD2,AccGSTS4,AccCYP4G11,AccGSTO2和AccGSTD基因表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),這些抗氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平在AccMKK6沉默后降低。檢測到AccMKK6沉默后中華蜜蜂體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性降低,但是丙二醛(MDA)含量升高。AccMKK6-Accp38b-Acckayak級聯(lián)途徑參與中華蜜蜂抗氧化應(yīng)激過程。通過酵母雙雜交和GST pull-down實(shí)驗(yàn)得到AccMKK6的下游基因Accp38b,并發(fā)現(xiàn)Accp38b與Acckayak互作。研究發(fā)現(xiàn)Acckayak基因的轉(zhuǎn)錄水平受過氧化氫、重金屬和農(nóng)藥等非生物脅迫誘導(dǎo)提高。同時,AccMKK6沉默后Accp38b和Acckayak的轉(zhuǎn)錄水平升高。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S891
【部分圖文】：

圖 1-1 在受體-配體相互作用后，不同的細(xì)胞外刺激可以激活絲裂原激活蛋白激酶家族。這個家族的成員通過在絲氨酸/蘇氨酸氨基酸中加入磷酸基來相互激活。（Hommes et al., 2003）Fig. 1-1 Different extracellular stimuli can activate the family of mitogen activated protein (MAP) kinases afterreceptor-ligand interactions. Members of this family activate each other by adding phosphate groups to serine/threonineamino acids.MKKK 數(shù)目眾多，目前為止在哺乳動物基因組中發(fā)現(xiàn) 14 種 MKKK，擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn) 80 種 MKKK，水稻基因組中發(fā)現(xiàn) 75 種（C et al., 1999；Singh et al., 2012；Hadiartoet al., 2006）。在結(jié)構(gòu)上，MKKK 家族基因存在許多特殊的結(jié)構(gòu)域以便于感知并結(jié)合外源信號分子，從而開啟多種不同的信號通路。這些結(jié)構(gòu)域包括能夠與膜上磷酸肌醇類化合物 PIP2、PIP3、PI3等結(jié)合的 PH 結(jié)構(gòu)域（Pleckstrin homolgy domain）、能夠識別并結(jié)合富含脯氨酸和疏水殘基的蛋白質(zhì)的 SH3 結(jié)構(gòu)域（Src homology domain）、G 蛋白結(jié)合位點(diǎn)（Binding sites for G proteins）、鋅指結(jié)構(gòu)域（Zinc finger domain）以及亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（Leucine zipper domain）等（Hirt, 2000）。MKK 能夠?qū)⑿盘柗肿訌纳嫌?MKKK 傳遞到下游 MAPK，被看作是 MAPK 信號通

圖 3-1 中華蜜蜂 AccMKK6 基因的分離獲得DL2000 DNA Marker；1-3，AccMKK6 的 PCR 反應(yīng)產(chǎn)Fig. 3-1 Isolation of AccMKK6 open reading frameL2000 DNA Marker; 1-3, PCR reaction products of Acc6編碼的氨基酸序列分析站 ExPASY 對分離獲得的中華蜜蜂 AccM放閱讀框長為 1002bp，編碼一個 333 3kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為 7.15。件對不同物種的多個 MKK6 氨基酸序與意大利蜜蜂 AmMKK6（XP_00656238.1）、小菜蛾 PxMKK6（XP_011548及伊蚊 AaMKK6（XP_021704117.1）的 93.7%，91%，73.5%，73.1%，70.7%。

中華蜜蜂 MKK6 基因介導(dǎo)的 MAPK 級聯(lián)途徑在氧化應(yīng)激中的功能分析框標(biāo)出的 SxxxT 基序�；谥腥A蜜蜂和意大利蜜蜂、家蠶、果蠅等昆蟲的 MKK 氨基序列，采用鄰結(jié)法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖 3-2B 中可以看出昆蟲的MKK明顯分為MKK1、MKK4、MKK3/6、MKK7四個支。AccMKK6屬于MKK3支，與意大利蜜蜂的 AmMKK3 有密切的進(jìn)化關(guān)系。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張立微;張紅玉;;傳粉昆蟲生態(tài)作用研究進(jìn)展[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年07期

2 李捷;朱朝東;王鳳鶴;黃敦元;張彥周;丁亮;黃海榮;;野生蜜蜂及其傳粉作用的研究現(xiàn)狀[J];生物多樣性;2007年06期

本文編號：2810957