粘細(xì)菌(Myxobacteria)是一類具有社會性行為的高等原核生物,具有復(fù)雜的多細(xì)胞行為和形態(tài)發(fā)生,在細(xì)胞分化、發(fā)育以及生物進(jìn)化研究中占有重要的地位。其代謝產(chǎn)物具有豐富、多樣、新穎的生物活性,是篩選天然藥物的良好資源,具有很大的研究開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。馬鈴薯是世界上僅次于水稻、小麥和玉米的第四大糧食作物,也是我國的第四主糧。我國是世界上馬鈴薯第一生產(chǎn)大國,在云貴、華北、東北等氣候相對較涼的地區(qū)種植。馬鈴薯最為嚴(yán)重的病害為晚疫病(Potato Late Bright),其病原菌為致病疫霉(Phytophthora infestans)。P.infestans主要侵害葉、莖和薯塊,是一種能夠?qū)е埋R鈴薯莖葉死亡和塊莖腐爛的毀滅性病害。因此,研發(fā)高效無害的防治馬鈴薯晚疫病的農(nóng)藥迫在眉睫。本研究從位于內(nèi)蒙古自治區(qū)的中部地區(qū)共采集139份土壤樣品,并對土樣的含水量、pH、有機(jī)質(zhì)、速效鉀、水解氮、有效磷等參數(shù)進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示,內(nèi)蒙古中部地區(qū)的土樣基本為中性偏堿性,且土樣的含水量很低,土壤肥力狀況普遍較差。采用兔糞誘導(dǎo)、大腸桿菌劃線誘導(dǎo)以及濾紙誘導(dǎo)三種方法對139份土壤樣品中的粘細(xì)菌進(jìn)行分離,通過將直接挑取子實(shí)體、抗生素處理以及二次誘導(dǎo)等多種方法相結(jié)合進(jìn)行純化,發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古中部地區(qū)的粘細(xì)菌優(yōu)勢種屬包括6個(gè)屬,分別為Myxococcus、Corallococcus、Pyxidicoccus、Cystobacter、Archangium、Melittangium。內(nèi)蒙古中部包頭地區(qū)的粘細(xì)菌資源最為豐富,烏蘭察布地區(qū)的粘細(xì)菌資源豐富度較差。草地與耕地樣品中粘細(xì)菌的種群較為豐富,而林地與未利用土地樣品的種群較少。潮土、灰褐土、栗鈣土和沼澤土的粘細(xì)菌表現(xiàn)出了較豐富的多樣性,而風(fēng)沙土、堿土、粗骨土與栗褐土樣品中粘細(xì)菌的豐富度較差。通過分析粘細(xì)菌的分布與環(huán)境參數(shù)之間的相關(guān)性可知土壤樣品的環(huán)境參數(shù)與粘細(xì)菌的分布并未表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性,可能是由于目前分離到的菌株數(shù)不能代表土樣中的實(shí)際菌株數(shù)或者是由其他未檢測的環(huán)境因子的影響所造成的。以馬鈴薯晚疫病致病菌致病疫霉HQK8-3為供試病菌,采用平板對峙培養(yǎng)法對已純化的粘細(xì)菌菌株拮抗致病疫霉菌的活性進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示內(nèi)蒙古中部地區(qū)83%的粘細(xì)菌菌株具有抗致病疫霉活性,其中Myxococcus和Corallococcus屬的抗病菌株比例較高,Cystobacter和Melittangium屬的抗病菌株比例居中,Pyxidicoccus和Archangium屬的抗病菌株比例較低。菌株B25-I-1、B25-I-3與X6-II-1對致病疫霉的拮抗活性較為顯著。通過結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rRNA基因序列,進(jìn)一步確定菌株B25-I-1為黃色粘球菌(Myxococcus xanthus);B25-I-3為橙色粘球菌(Myxococcus fulvus);X6-II-1為葉柄粘球菌(Myxococcus stipitatus)�？辜�(xì)菌與抗真菌活性表明,菌株B25-I-1與B25-I-3可以殺死和溶解大腸桿菌(Escherichia coli),并對枯草芽孢桿菌(Bcicius subtilis)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solanikuhn)、向日葵核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)和大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)均表現(xiàn)出了不同程度的抑制作用,對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)卻并未表現(xiàn)出抑制活性;菌株X6-II-1也可以殺死和溶解大腸桿菌,并對枯草芽孢桿菌和尖孢鐮刀菌表現(xiàn)出了抑制作用,對其它指示菌并未表現(xiàn)出抑制活性。促生能力的檢測結(jié)果表明,菌株B25-I-1、B25-I-3以及X6-II-1在產(chǎn)氨、解磷、產(chǎn)脲酶、產(chǎn)吲哚乙酸、產(chǎn)氫氰酸和產(chǎn)幾丁質(zhì)酶等方面均未表現(xiàn)出促生作用,但卻都顯示出產(chǎn)鐵載體的能力。采用稱重法分別測定了粘細(xì)菌菌株B25-I-1、B25-I-3以及X6-II-1的生長曲線,發(fā)現(xiàn)菌株B25-I-1在接種第6天時(shí),菌體重量達(dá)到最大值;菌株B25-I-3在接種第7天達(dá)到菌體重量的最大值;菌株X6-II-1在接種第7天時(shí),菌體重量達(dá)到最大。采用濾紙片法對菌株B25-I-1、B25-I-3以及X6-II-1產(chǎn)生的抑制致病疫霉菌絲生長的活性物質(zhì)的分布進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,菌株B25-I-1、B25-I-3以及X6-II-1產(chǎn)生的拮抗馬鈴薯晚疫病菌活性物質(zhì)分布于胞外。通過單因素分析與正交優(yōu)化相結(jié)合的方法對三株菌的發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,菌株B25-I-1的最適發(fā)酵條件為:溫度32℃、時(shí)間8 d,接種量10%;菌株B25-I-3的最適發(fā)酵條件為:溫度30℃、時(shí)間7 d,接種量10%;菌株X6-II-1的最適發(fā)酵條件為:溫度30℃、時(shí)間7 d,接種量10%。以馬鈴薯晚疫病致病菌致病疫霉HQK8-3為供試病菌,采用濾紙片法對菌株B25-I-1與B25-I-3的發(fā)酵濃縮液中的抑制致病疫霉菌絲生長的活性物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示菌株B25-I-1與B25-I-3發(fā)酵產(chǎn)生的活性物質(zhì)對溫度有著極強(qiáng)的耐受性,還耐受蛋白酶K的處理以及紫外光照射和自然光照射,且易于在低溫條件下長期保存�；钚晕镔|(zhì)抗細(xì)菌與抗真菌活性表明,菌株B25-I-1與B25-I-3發(fā)酵產(chǎn)生的具有抑制致病疫霉菌絲生長活性的次級代謝產(chǎn)物對細(xì)菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和真菌釀酒酵母菌、尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌、向日葵核盤菌均表現(xiàn)出了不同程度的拮抗作用。通過研究菌株B25-I-1與B25-I-3發(fā)酵產(chǎn)生的活性物質(zhì)對致病疫霉的生防機(jī)制,發(fā)現(xiàn)兩株菌發(fā)酵產(chǎn)生的活性物質(zhì)對致病疫霉的無性生殖和有性生殖都具有較強(qiáng)的抑制作用,此外還可降低致病疫霉菌體可溶性蛋白的含量和菌體保護(hù)酶(PPO、POD、PAL、SOD)的活性,增加細(xì)胞膜的氧化損傷與通透性,這些可能就是菌株B25-I-1與B25-I-3活性物質(zhì)對致病疫霉的生防機(jī)制。對菌株B25-I-1與B25-I-3發(fā)酵產(chǎn)生的活性物質(zhì)對馬鈴薯離體葉片的防病作用進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示菌株B25-I-1與B25-I-3發(fā)酵產(chǎn)生的活性物質(zhì)均具有明顯抑制致病疫霉侵染馬鈴薯葉片的活性且對不同品種的馬鈴薯葉片無損傷作用。菌株B25-I-1與B25-I-3發(fā)酵產(chǎn)生的活性物質(zhì)經(jīng)TLC與HPLC等初步分離后,將具有抗致病疫霉活性的組分進(jìn)行HPLC-MS檢測,發(fā)現(xiàn)菌株B25-I-1與B25-I-3對致病疫霉的拮抗組分中均含有Methyl(2R)-2-azido-3-hydroxyl-2-methylpropanoate與N-(3-Amino-2-hydroxypropyl)-N-meth-ylsulfuric diamide兩種物質(zhì)。本研究為首次對內(nèi)蒙古中部地區(qū)粘細(xì)菌資源的多樣性進(jìn)行研究,并在此基礎(chǔ)上篩選對致病疫霉生長具有顯著抗性的菌株,并對其抗馬鈴薯晚疫病菌活性進(jìn)行了分析,該工作的完成可能為豐富我國粘細(xì)菌資源以及研發(fā)源于粘細(xì)菌資源的抗馬鈴薯晚疫病等植物疫病的生物農(nóng)藥提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S435.32
【部分圖文】：

圖 1 粘細(xì)菌研究的時(shí)間線Fig.1 Timeline of myxobacteria research 粘細(xì)菌的分布粘細(xì)菌的分布十分廣泛，在土壤、沙漠和湖水中都有發(fā)現(xiàn)，有時(shí)也可以在片表面被發(fā)現(xiàn)[18]，但是粘細(xì)菌會優(yōu)先選擇長在原生的土壤中、或者是富含有機(jī)質(zhì)的土壤中[19]，一般喜好生活在溫暖干燥的中性環(huán)境，最適pH通常為，其中,嗜纖維素的粘細(xì)菌生活環(huán)境的最適pH略低，一般為5.8～6.4。但近年

雖然研究表明在溫暖的半干旱地區(qū)發(fā)現(xiàn)的粘細(xì)菌豐富度最高，但在極端環(huán)境中也有粘細(xì)菌的存在。下圖2展示了基于部分宏基因組數(shù)據(jù)的粘細(xì)菌的全球分布圖。粘細(xì)菌的分布與采樣的范圍有著密切的關(guān)系，其中，取自歐洲以及美國的數(shù)據(jù)相對比較多，而來自亞

注：*表示部分粘細(xì)菌新的科屬尚無對應(yīng)的中文名稱此外，根據(jù)粘細(xì)菌“食性”的不同，還可以將其簡單地劃分為兩個(gè)生理類群，即溶纖維素類群和溶細(xì)菌類群。兩者的營養(yǎng)方式有著顯著的差異。其中，溶纖維素群粘細(xì)菌可分解纖維素[ 27 ]，目前已確認(rèn)的只有一個(gè)屬一個(gè)種，即纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)；而溶細(xì)菌群粘細(xì)菌能高效率地分解酵母、大腸桿菌等微生物的整個(gè)細(xì)胞和各種成分，包括粘球菌屬(Myxococcus)、孢囊桿菌屬(Cystobacter)、珊瑚球菌屬(Corallococcus)等其余 19 個(gè)屬。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2808343